Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株制备及应用制造技术

本申请公开了Claudin6

【技术实现步骤摘要】
Claudin6
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mCherry报告基因CHO
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K1稳转细胞株制备及应用


[0001]本申请涉及生物医药
，尤其涉及Claudin6
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mCherry报告基因CHO
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K1稳转细胞株制备及应用。

技术介绍

[0002]Claudins(CLDNs)蛋白家族最早是在1998年被发现的，由Furuse Mikio等人从鸡肝中克隆得到并为之命名。该家族蛋白是紧密连接(Tight junctions，TJs)的重要组成成分，在哺乳动物中，迄今为止发现了27个Claudins成员，大量研究已证实，Claudins家族是TJs必不可少的骨架蛋白，在维持上皮和内皮细胞中的细胞极性、细胞间的粘附固定、细胞旁路的离子运输等方面发挥重要作用。
[0003]Claudin6(UniProt ID：P56747)的分子量为23kDa，有四个跨膜结构域，两个胞外域和一个胞内域，胞内域含有一个PDZ结合区，可以募集具有PDZ结构域的蛋白AF
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6，AF
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6与Ras结合，抑制Ras和Raf的结合，使得Ras不能被Raf激活，从而抑制Ras的活性，进一步抑制下游靶分子如ERK和PI3K等信号通路，进而调控细胞的行为。Claudin6的两个胞外结构域，分别是位于29～81和138～160之间的氨基酸，相对较短，是开发治疗性抗体最重要的片段。Claudin6可以与信号蛋白和细胞骨架蛋白结合，参与细胞外和细胞内信号传递的细胞应答。
[0004]大量研究表明，Claudin6基因可能直接或间接参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡等功能的调节，具体的调节机制有待进一步阐明，目前的研究普遍认为，Claudin6的异常表达或者磷酸化水平的改变会导致紧密连接的正常结构发生变化，进而影响细胞的之间的粘附，并导致一些分子的异常扩散，进而促进肿瘤的增值和迁移。Claudin6在卵巢癌、睾丸癌、乳腺癌，宫颈癌，肝细胞癌和肺腺癌等多种癌症中特异表达，在癌细胞上差异表达，而在成人正常组织中几乎检测不到，这使得它成为极具检测和治疗潜力的TAA靶点。ParmSnap数据库显示，已有10多家企业布局Claudin6研发管线，包括抗体、ADC、双特异性抗体、CAR
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T、RNA疫苗等多种形式，其中进展最快的是日本安斯泰来制药的抗体药IMAB
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027和德国拜恩泰科的CAR
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T疗法，目前都已经进入临床二期。其中，德国拜恩泰科披露的BNT211 CAR
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T+CARVac联合治疗Claudin6阳性实体瘤的临床初步数据显示，在16名接受治疗患者中，Claudin6CAR
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T治疗具有良好的耐受性和安全性，且疾病控制率达到86％，客观缓解率ORR为43％，这意味着Claudin6基因是治疗实体瘤非常有价值的靶点。
[0005]由于Claudin6蛋白位于细胞膜表面，在体外获得有活性的Claudin6蛋白十分困难，因此，亟需开发出一种Claudin6基因的稳转细胞株，能够在体外表达出有活性的Claudin6蛋白，这对于与该靶点相关的药物开发和检测均有十分重要的意义。

技术实现思路

[0006]本申请的目的是提供一种Claudin6
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mCherry报告基因CHO
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K1稳转细胞株构建和应用，以至少解决上述部分技术问题。
[0007]第一方面，本申请提供了一种重组质粒，构建所述重组质粒包括将Claudin6基因的序列和mCherry基因的序列使用linker进行连接融合，同时添加HIS标签的步骤，所述重组质粒全长DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
[0008]第二方面，本申请提供了一种Claudin6
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mCherry报告基因CHO
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K1稳转细胞株，其中，mCherry(Unipot ID：X5DSL3)是一种红色荧光蛋白，是一种目前被广泛用于生物技术作为示踪剂的红色荧光染料，包括分子的标记和细胞组分的定位等。mCherry因为其颜色和单体分子的光稳定性，细胞毒性低。比其它荧光蛋白标签更优异，其最大激发光和发射光分别为587nm和610nm；所述CHO
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K1稳转细胞株通过如下方法获得：
[0009]将第一方面所述的重组质粒，构建到三代慢病毒表达质粒中包装慢病毒；
[0010]使用包装好的慢病毒稳定转染CHO
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K1细胞，获得稳定表达Claudin6
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mCherry融合蛋白的CHO
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K1细胞；
[0011]进一步使用流式分选将mCherry阳性的细胞分离出来，并扩增培养，经过进一步的功能验证，获得能够稳定表达有活性的Claudin6蛋白的CHO
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K1单克隆细胞株。
[0012]进一步地，所述Claudin6
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mCherry报告基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述Claudin6
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mCherry报告基因翻译表达出来的Claudin6
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mCherry融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0013]第三方面，本申请提供了通过第一方面所述重组质粒或第二方面所述CHO
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K1稳转细胞株在表达Claudin6蛋白的应用。
[0014]与现有技术相比，本申请的优点及积极效果至少如下：
[0015](1)通过本申请提供的CHO
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K1稳转细胞株表达出的Claudin6蛋白产量稳定、质量高。
[0016](2)本申请提供的CHO
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K1稳转细胞株的构建方法步骤简便，易于实施。
附图说明
[0017]图1为本申请实施例提供Claudin6
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mCherry慢病毒转染效率图，其中A为没有转染Claudin6
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mCherry慢病毒的CHO
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K1细胞流式图，B为转染Claudin6
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mCherry慢病毒48小时后的CHO
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K1细胞流式图。
[0018]图2为本申请实施例提供的第14天检测96孔板中的Claudin6阳性分布图，其中A为96孔板中mCherry信号强度的分布图，B为Claudin6蛋白的表达信号强度分布图。
[0019]图3为本申请实施例提供的单克隆细胞株中CLDN6和mCherry的表达图，其中A为野生型CHO
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K1细胞中CLDN6和mCherry表达量的流式图，B为筛选到的单克隆细胞株中CLDN6和mCherry表达量的流式图。
具体实施方式
[0020]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合基因，其包括Claudin6基因的序列、mCherry基因的序列、HIS标签序列以及连接Claudin6基因和mCherry基因的linker，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种重组质粒，其包括权利要求1所述融合基因，其中，构建所述重组质粒包括将Claudin6基因的序列和mCherry基因的序列使用linker进行连接融合，同时添加HIS标签的步骤；所述重组质粒全长DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.一种融合蛋白，其通过权利要求1所述融合基因或权利要求2所述重组质粒表达获得；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.一种慢病毒载体，其包括权利要求2所述重组质粒。5.根据权利要求4所述的慢病毒载体，其构建过程包括以下步骤：将三种包装质粒pL1、pL2、pL3和权利要求2所述重组质粒按照2:1:1:2的质量比进行混合，获得混合质粒；将混合质粒用无血清培养基溶解，将混有PEI的溶液逐滴加入到混合质粒的溶液中，获得混合液；将上述混合液加入到24孔板中，进行培...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄阳，岳涵，程昊，陈嘉琛，
申请(专利权)人：优睿赛思武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：