【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地，本专利技术涉及一种编码嵌合抗原受体和fcrγ的核酸构建体、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其应用。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t(chimeric antigen receptor t，car-t)细胞在血液恶性肿瘤治疗中取得了令人瞩目的效果。car分子的抗原识别区通常采用来自抗体的scfv序列，该序列通常来自鼠、兔、羊驼等种属，具有较强的免疫原性。即使对其序列进行人源化改造，仍然存在一定的免疫原性，产生抗药物抗体(ada)，削弱car-t细胞在体内的持久性。近年来，有许多新技术应用于解决该问题，例如采用天然受体蛋白序列作为感受器，以降低免疫原性。
2、nkp30受体是一种天然的nk细胞活化性受体，在nk细胞上高表达，可识别b7h6分子，进而介导细胞毒性作用。b7h6是b7家族中的一员，b7h6分子通常在多种原发肿瘤细胞上高表达，包括白血病、淋巴瘤、结直肠癌、胃癌和胰腺癌等，而在正常组织细胞上几乎不表达。目前，以nkp30胞外段作为b7h6识别的感受器，以此为基础构建的car-t细胞的功能已经在研究中得到验证(an nkp30-based chimeric antigen receptor promotes t celleffector functions and antitumor efficacy in vivo.j immunol.2012sep1；189(5):2290-9.doi:10.4049/jimmunol.1103495.专利申请号us14342060，
3、基于以上研究和开发现状，有待于进一步研究杀伤活性更高的表达嵌合抗原受体的免疫细胞。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了编码嵌合抗原受体和fcrγ的核酸构建体、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其应用，本专利技术的核酸构建体编码嵌合抗原受体和fcrγ分子，携带本专利技术核酸构建体的免疫细胞，可同时表达嵌合抗原受体和fcrγ分子，而且嵌合抗原受体表达丰度高，肿瘤细胞杀伤活性高，疗效好，临床应用价值高。
2、需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的：
3、自然杀伤(nk)细胞是抗肿瘤免疫的主要成员之一，其可通过多种途径参与抗肿瘤免疫应答。nk细胞表面高表达nk细胞毒性受体(ncr)nkg2d、nkp30、nkp44与nkp46等，其相关配体往往在恶性转化或衰老的细胞上高表达。当nk细胞识别相关配体后可介导强效的细胞毒性作用，清除恶性转化或衰老的细胞。近年来的研究发现，nkp30存在多种变体，分别为nkp30a、nkp30b、nkp30c、nkp30d、nkp30e与nkp30f。不同变体之间的功能存在显著差异。激活nkp30a后，可介导nk细胞最强的杀伤活性与分泌ifn-γ能力，其次是nkp30b，而激活nkp30c后，nk细胞的杀伤活性与分泌ifn-γ能力没有明显提高，反而促进了分泌免疫抑制因子il-10的能力。由此，专利技术人基于天然nkp30a序列，保留了nkp30a序列中第143位的精氨酸，并通过大量试验筛选出了一条nkp30a氨基酸序列(1-147)。进一步试验结果证明，基于该nkp30a氨基酸序列构建的嵌合抗原受体，对nk细胞的激活作用显著增强。由此得到的转基因免疫细胞能有效杀伤b7h6阳性肿瘤细胞，并且安全性高。
4、进一步地，专利技术人创造性将上述嵌合抗原受体与fcrγ分子在免疫细胞中共同表达，进一步试验结果显示：前述nkp30受体的表达丰度进一步提高，免疫细胞的肿瘤细胞杀伤活性显著提高。
5、进一步地，专利技术人将不同的嵌合抗原受体与fcrγ分子在免疫细胞中共同表达，观察到了相同的结果。
6、因此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种核酸构建体。所述核酸构建体包括第一核酸分子和第二核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体，所述第二核酸分子编码fcrγ；其中，
7、所述嵌合抗原受体包括胞外区、跨膜区和胞内区，所述跨膜区的n端与所述胞外区的c端相连，所述胞内区的n端与所述跨膜区的c端相连。
8、需要说明的是，本专利技术涉及的氨基酸序列均按照n端至c端的方式示出。
9、根据本专利技术实施例的携带上述核酸构建体的免疫细胞，可同时表达嵌合抗原受体和fcrγ分子，而且嵌合抗原受体表达丰度高，免疫细胞杀伤活性高，疗效好，临床应用价值高。
10、在本文中，术语“表达嵌合抗原受体的免疫细胞”，等同于“car-免疫细胞”，是一种转基因免疫细胞，表达特定的嵌合抗原受体，进一步用于疾病的预防和/或治疗。在一些情况下，结合上下文，等同于“转基因免疫细胞”。
11、根据本专利技术的实施例，所述胞外区具有b7h6结合活性。根据本专利技术实施例的核酸构建体编码能识别b7h6分子的嵌合抗原受体和fcrγ分子，由此，实现该嵌合抗原受体在细胞表面的高表达。
12、根据本专利技术的实施例，所述胞外区包括nkp30胞外段或其片段。根据本专利技术实施例的核酸构建体编码nkp30嵌合抗原受体和fcrγ分子，由此，实现该nkp30嵌合抗原受体在细胞表面的高表达，得到nkp30嵌合抗原表达丰度高、肿瘤细胞杀伤活性高的免疫细胞。
13、根据本专利技术的实施例，所述胞外区具有如seq id no：1、2或3所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列。
14、根据本专利技术的实施例，所述胞外区具有如seq id no：1所示的氨基酸序列。由此，进一步提高该核酸构建体编码的nkp30嵌合抗原受体的肿瘤细胞杀伤活性。
15、根据本专利技术的实施例，所述胞内区包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
16、根据本专利技术的实施例，所述共刺激因子结构域的c端与所述胞内信号传导结构域的n端相连。
17、根据本专利技术的实施例，所述共刺激结构域选自cd3ζ、cd28、4-1bb、2b4、dap10、dap12、cd27、cd40、ox40、icos胞内段或其片段的至少之一。
18、根据本专利技术的实施例，所述共刺激结构域为cd28胞内段或其片段。
19、根据本专利技术的实施例，所述cd28胞内段具有如seq id no：4所示的氨基酸序列。
20、根据本专利技术的实施例，所述胞内信号传导结构域为cd3ζ分子胞内段或其片段。
21、根据本专利技术的实施例，所述cd3ζ分子胞内段具有如seq id no：5所示的氨基酸序列。
22、根据本专利技术的实施例，所述跨膜区选自nkp30分子跨膜区、cd3ζ分子跨膜区、cd28分子跨膜区之一。
23、根据本专利技术的实施例，所述跨膜区具有如seq id n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸构建体，其特征在于，包括第一核酸分子和第二核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体，所述第二核酸分子编码FcRγ；其中，
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述胞外区具有B7H6结合活性；
3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述FcRγ有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；
4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其特征在于，进一步包括第三核酸分子，所述第三核酸分子编码第一连接子，第一核酸分子和第二核酸分子通过所述第三核酸分子相连；
5.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有如SEQ ID NO：16或17所示的核苷酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求1～5任一项所述的核酸构建体；
7.一种慢病毒载体，所述慢病毒表达载体携带具有如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列的构建体。
8.一种转基因免疫细胞，其特征在于，所述转基因免疫细胞包括：
9.一种药物组合物，其特征在于，包
10.权利要求1～5任一所述的核酸构建体、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的慢病毒载体、权利要求8所述的转基因免疫细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗B7H6靶点介导的相关疾病；
...【技术特征摘要】
1.一种核酸构建体，其特征在于，包括第一核酸分子和第二核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体，所述第二核酸分子编码fcrγ；其中，
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述胞外区具有b7h6结合活性；
3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述fcrγ有如seq id no：10所示的氨基酸序列；
4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其特征在于，进一步包括第三核酸分子，所述第三核酸分子编码第一连接子，第一核酸分子和第二核酸分子通过所述第三核酸分子相连；
5.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有如seq id no：...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡渊，张彩，王烃，周英利，陈敏华，
申请(专利权)人：上海恩凯细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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