【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物学领域，涉及一株产黑色素短梗霉菌株(aureobasidiummelanogenum)，具体涉及一株产物单一、且易于提取的胞外β-葡聚糖的产黑色素短梗霉bzwδags2-1/2工程菌株及使用方法。
技术介绍
1、β-1,3-葡聚糖(β-葡聚糖)是通过β-1,3线性糖苷键连接起来的聚合物，是一种重要的生物活性多糖，广泛分布于植物、细菌和真菌中，具有重要的营养价值和生物功能。近年来，β-葡聚糖在医药、食品、化妆品、饲料添加剂等领域越来越受到人们的关注，有关β-葡聚糖活性及应用等方面的研究逐年增加。β-葡聚糖的生产通常采用化学、物理和酶法等方法进行提取，原料主要包括植物、真菌、酵母以及藻类；其中在酵母细胞壁中含量最高，β-葡聚糖是构成酵母细胞壁的主要成分，位于细胞壁的最内层，占细胞壁干重的30％～60％。
2、然而，现有技术中从酵母细胞壁提取并纯化的商业β-葡聚糖的成本很高，而且所得到的产品纯度较低(一般低于50％)，需要进一步的纯化。短梗霉属的酵母菌(通常称为“黑酵母”)是一类十分有潜力的β-葡聚糖合成菌株。其将葡萄糖转变为尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)，进而利用udpg合成β-葡聚糖，作为细胞壁组分。但是，udpg同时也是短梗霉属酵母菌另一种多糖产物——普鲁多糖的合成前体。所以，为提高β-葡聚糖的产量，一方面需要增加胞内udpg的供给，另一方面需要提高β-葡聚糖合成酶的活性，且降低普鲁兰合成酶的活性。kang等人通过敲除野生型菌株中的普鲁兰合成酶基因后得到突变株np1221，与野生型菌株相比，该突变株
3、综上可知，现有技术中葡聚糖的产量最高仅为9.9g/l，且副产物普鲁兰并没有完全消除，对β-葡聚糖的纯度起到了消极的效果。目前，尚没有产物单一的胞外β-葡聚糖生产菌株的相关报道。
技术实现思路
1、基于现有技术中微生物发酵制备β-葡聚糖的现状，本申请提供了一株产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)bz-11菌株。所述的产黑色素短梗霉bz-11菌株不仅能合成细胞壁β-葡聚糖，还能产生胞外β-葡聚糖，填补了现有技术的空白。此外，本申请在产黑色素短梗霉bz-11菌株的基础上构建得到产黑色素短梗霉bzwδags2-1/2工程菌株。所述工程菌株通过阻断黑色素和普鲁兰多糖的合成，不仅去除胞外β-葡聚糖的色素和普鲁兰多糖的污染，提升产品纯度，同时增加了β-葡聚糖合成所需的能量和前体供应，从而提高了β-葡聚糖的产量，产业应用前景广阔。
2、本专利技术的技术方案：
3、一株产β-葡聚糖的产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)菌株，所述产黑色素短梗霉菌株命名为产黑色素短梗霉bz-11菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2023831，保藏日期为2023年05月26日，保藏地址为中国武汉武汉大学。与现有技术中相关菌株均属于胞内合成β-葡聚糖不同，所述的产黑色素短梗霉bz-11菌株不仅产生细胞壁β-葡聚糖，还能产生胞外β-葡聚糖，填补了现有技术的空白。需要说明的是，胞外β-葡聚糖可以直接醇沉提取，与细胞壁β-葡聚糖采用的碱提法分离相比，不但简化了提取过程、降低了生产成本，而且避免了对环境的污染，从而为β-葡聚糖的产业化生产提供了切实可行的技术方案。
4、如前所述的产黑色素短梗霉菌株的应用，将所述的产黑色素短梗霉bz-11菌株用于发酵生产β-葡聚糖。
5、提高β-葡聚糖产量的产黑色素短梗霉菌株工程菌株，采用下述方法构建得到：
6、(1)利用同源重组，构建bz-11菌株的pks基因敲除载体、ags2-1基因敲除载体和ags2-2基因敲除载体。其中，pks基因是涉及合成黑色素的关键基因，为聚酮合酶的基因序列seq id no：1；ags2-1和ags2-2双拷贝基因是涉及合成普鲁兰多糖的关键基因，分别为葡聚糖合成酶的基因序列seq id no：2和seq id no：3。
7、(2)通过电击转化的方法，把步骤(1)构建好的基因敲除载体分三次转入如前所述的bz-11菌株中，构建得到敲除pks、ags2-1/2三基因的bz-11改造菌株，即产黑色素短梗霉bzwδags2-1/2工程菌株。所述工程菌株在bz-11菌株同时发酵生产细胞壁和胞外β-葡聚糖优势的基础上，通过遗传改造阻断了黑色素和普鲁兰多糖的合成，不但得到了无色素的β-葡聚糖，优化了产品的卖相，而且增加了β-葡聚糖的积累，实现了β-葡聚糖产量和纯度的大幅度提升，可高达29.64g/l，具有重要的产业化应用前景。
8、采用如前所述方法构建的提高β-葡聚糖产量的产黑色素短梗霉工程菌株。
9、如前所述的产黑色素短梗霉bzwδags2-1/2工程菌株的活化方法，将所述工程菌株接种到ypd固体培养基中，在28℃的温度条件下培养24-48小时。
10、一种包含前所述的产黑色素短梗霉bzwδags2-1/2菌株的菌剂。
11、如前所述的产黑色素短梗霉工程菌株以葡萄糖为底物发酵生产β-葡聚糖的应用。具体操作为：
12、(1)将如前所述的产黑色素短梗霉bzwδags2-1/2工程菌株接入种子培养基，进行种子培养，培养后得到菌体细胞。所述的种子培养基为：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l。
13、(2)然后将菌体细胞接入到发酵培养基，28℃-30℃发酵，发酵完成后从发酵液中分离得到胞外β-葡聚糖，从菌体中分离得到细胞壁β-葡聚糖。所述的发酵培养基为：90-140g/l葡萄糖，0.2g/l酵母粉，0.1-0.2g/l硝酸钠，7g/l磷酸二氢钾，2.5g/l十二水和磷酸氢二钠，2.5g/l七水硫酸镁，0.15g/l氯化铁和氯化钙，0.02g/l硫酸锰和硫酸锌。其中，从发酵液中分离得到胞外β-葡聚糖的方法为醇沉法，从菌体中分离得到细胞壁β-葡聚糖的方法为碱提法。
14、所述的工程菌株bzwδags2-1/2以葡萄糖为碳源发酵生产β-葡聚糖的产量为29.64g/l，且其中胞外β-葡聚糖的产量为17.81g/l，这对于β-葡聚糖的工业化生产有重要意义。
15、本专利技术的有益效果：
16、(1)本申请首先提供了一株产β-葡聚糖的产黑色素短梗霉bz-11菌株，所述菌株不仅能产生细胞壁葡聚糖，还能产生胞外葡聚糖，与现有技术中相关菌株均只能产生细胞壁β-葡聚糖不同，填补了现有技术的空白。
17、(2)在前述产黑色素本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株产β-葡聚糖的产黑色素短梗霉菌株，其特征在于：所述产黑色素短梗霉菌株命名为产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BZ-11菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023831，保藏日期为2023年05月26日。
2.如权利要求1所述的产黑色素短梗霉菌株的应用，其特征在于：将所述的产黑色素短梗霉BZ-11菌株用于发酵生产β-葡聚糖。
3.提高β-葡聚糖产量的产黑色素短梗霉菌株工程菌株，其特征在于：采用下述方法构建得到：
4.根据权利要求3所述的产黑色素短梗霉菌株工程菌株，其特征在于：所述PKS基因是涉及合成黑色素的关键基因，基因序列为SEQ ID NO：1；所述AGS2-1和AGS2-2双拷贝基因是涉及合成普鲁兰多糖的关键基因，基因序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
5.采用权利要求3或4所述方法构建的提高β-葡聚糖产量的产黑色素短梗霉工程菌株。
6.如权利要求5所述的产黑色素短梗霉BZWΔags2-1/2工程菌株的活化方法，其特征
7.如权利要求5所述的产黑色素短梗霉工程菌株以葡萄糖为底物发酵生产β-葡聚糖的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将权利要求5所述的产黑色素短梗霉工程菌株接入种子培养基中进行种子培养，培养后得到菌体细胞；将菌体细胞接入到发酵培养基，发酵完成后从发酵液中分离得到胞外β-葡聚糖，从菌体中分离得到细胞壁β-葡聚糖。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的种子培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L；所述的发酵培养基为：90-140g/L葡萄糖，0.2g/L酵母粉，0.1-0.2g/L硝酸钠，7g/L磷酸二氢钾，2.5g/L十二水和磷酸氢二钠，2.5g/L七水硫酸镁，0.15g/L氯化铁和氯化钙，0.02g/L硫酸锰和硫酸锌。
10.根据权利要求8或者9所述的应用，其特征在于：所述发酵温度为28℃-30℃，从发酵液中分离得到胞外β-葡聚糖的方法为醇沉法，从菌体中分离得到细胞壁β-葡聚糖的方法为碱提法。
...【技术特征摘要】
1.一株产β-葡聚糖的产黑色素短梗霉菌株，其特征在于：所述产黑色素短梗霉菌株命名为产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)bz-11菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2023831，保藏日期为2023年05月26日。
2.如权利要求1所述的产黑色素短梗霉菌株的应用，其特征在于：将所述的产黑色素短梗霉bz-11菌株用于发酵生产β-葡聚糖。
3.提高β-葡聚糖产量的产黑色素短梗霉菌株工程菌株，其特征在于：采用下述方法构建得到：
4.根据权利要求3所述的产黑色素短梗霉菌株工程菌株，其特征在于：所述pks基因是涉及合成黑色素的关键基因，基因序列为seq id no：1；所述ags2-1和ags2-2双拷贝基因是涉及合成普鲁兰多糖的关键基因，基因序列分别为seq id no：2和seq id no：3。
5.采用权利要求3或4所述方法构建的提高β-葡聚糖产量的产黑色素短梗霉工程菌株。
6.如权利要求5所述的产黑色素短梗霉bzwδags2-1/2工程菌株的活化方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘光磊，赵文慧，王孝伟，周世良，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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