一种重组杆状病毒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组杆状病毒及其构建方法和应用，所述重组杆状病毒为将gp64

【技术实现步骤摘要】
一种重组杆状病毒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及重组病毒，具体属于一种重组杆状病毒及其构建方法，该重组病毒增殖能力强，可用于制备防治草地贪夜蛾幼虫的微生物杀虫剂。
技术背景
[0002]杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治的新型安全的生物农药，现今已经越来越受到人们的重视。相较于传统的化学农药来说，杆状病毒对于宿主昆虫具有高度的病原性，对于其它非靶标生物十分安全，能够在环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害，不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时具有防效时间长、使用方便等优点。因此，早在1973年，就被联合国粮农组织推荐作为化学农药的理想替代品。
[0003]但是，杆状病毒杀虫剂也有一定的缺点。在一定程度上，杆状病毒杀虫剂毒性小、增殖缓慢、见效慢。病毒在进入虫体后，要经历一段时间后才大量增殖而使害虫致死，一般需要7～14天。要在短期内快速杀虫的要求下无法满足杀虫需求。所以，提高杆状病毒在宿主害虫的增殖速度从而提高其抗虫活性已成为当今研发杆状病毒生物杀虫剂的发展方向。
[0004]由于杆状病毒基因组较大，不能直接对其进行操作插入外源基因，因此需要通过中间载体获得重组杆状病毒。GP64是杆状病毒出芽型病毒粒子(BV)囊膜上一种主要的糖蛋白。有研究表明，GP64上的跨膜结构域(transmembrane domain,TM)是决定GP64膜融合功能的关键，因此，本专利技术在gp64基因中扩增了一个TM结构域的序列，获得gp64
TM double
基因，构建了重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒AcMNPV
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gp64
TM double
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egfp。实验证明，该重组病毒可显著提高在宿主细胞中的增殖率，并减少对草地贪夜蛾幼虫的半致死时间，因此，可单独或联合其它抗虫或外源基因构建高效的重组杆状病毒杀虫剂。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒可以通过在感染草地贪夜蛾Sf9细胞后提升病毒的增殖率。
[0006]本专利技术的目的还在于提供一种该重组杆状病毒的构建方法，包括获得重组杆状病毒的中间载体的构建方法。
[0007]为实现本专利技术的上述目的，可以通过如下技术方案实现：
[0008]本专利技术提供的一种重组杆状病毒，该重组病毒为将序列为SEQ ID No.1所示的基因通过Bac
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to
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Bac转座重组系统整合到AcMNPV基因组中获得。该基因序列为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV的gp64
TM double
基因和水母增强型绿色荧光蛋白egfp基因的串联基因。
[0009]该重组杆状病毒可以在被感染的Sf9宿主细胞中表达融合蛋白GP64
TM double
‑
EGFP。
[0010]本专利技术提供的一种重组杆状病毒的构建方法，包括如下步骤：
[0011](1)以AcMNPV基因组为模板，通过PCR技术，以gp64
TM double
U
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F(SEQ ID No.2)和gp64
TM double
D
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R(SEQ ID No.5)为引物，扩增获得gp64基因片段；以gp64基因为模板，以
double
D
‑
F(SEQ ID No.4)和gp64
TM double
D
‑
R(SEQ ID No.5)为引物，扩增获得gp64
TM double
D片段。然后，通过搭桥PCR获得gp64
TM double
基因，且其两端分别带有Sam I酶切位点，将PCR产物经酶切后回收；同时对已构建好的中间载体pFastBacDual
‑
egfp进行Sam I酶切，酶切产物回收；将酶切后的PCR产物和中间载体用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃过夜培养，挑取单菌落在LB液体培养基中大量培养，纯化质粒做PCR鉴定和酶切鉴定，并将鉴定成功的质粒pFastBacDual
‑
gp64
TM double
‑
egfp进行测序确定。该质粒中包含SEQ ID No.1序列的基因。
[0026](2)重组AcMNPV基因组杆粒Bacmid
‑
gp64
TM double
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egfp的构建
[0027]将pFastBacDual
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gp64
TM double
‑
egfp转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒并转化大肠杆菌DH10B使其发生Tn7转座重组，将目的基因gp64
TM double
‑
egfp重组于AcMNPV基因组杆粒Bacmid上，然后涂布于含有卡那霉素和庆大霉素的固体培养基平板上，37℃过夜培养，挑取单个白色较大的菌落于5mL LB液体培养基中大量培养，提取并纯化杆粒Bacmid
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gp64
TM double
‑
egfp做PCR鉴定。
[0028](3)重组病毒AcMNPV
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gp64
TM double
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egfp的构建和增殖(见图2)
[0029]接种Sf9细胞于24孔细胞培养板中，待细胞有90％以上的汇合时，移去培养基并用PBS洗去残余的培养基。将筛选所得的重组杆粒Bacmid
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gp64
TM double
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egfp(μg)与转染试剂MirusbioMIR
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INSECT Transfection Reagent(μl)按1μg/3μl的量加入100μl无血清培养基中，剧烈震荡15s后，静置15min，加入Sf9细胞中，27℃孵育4h，然后补加无血清培养基400μl，转染4天以后荧光显微镜下观察，可以看到少数细胞内有绿色荧光，收集上清和细胞并经反复冻融使细胞破碎，离心收集上清，获得第一代病毒。由第一代病毒感染Sf9细胞，三天后收集细胞和上清液，并反复冻融使细胞破碎，离心收集上清液，获得第二代病毒。依次类推，获得第三代病毒，存储于4℃。图2为荧光显微镜镜检第一、二、三代重组病毒AcMNPV
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gp64
TM double
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egfp在Sf9细胞内发出的绿色荧光。
[0030]实施例2将Sf9细胞铺至12孔板中，用5MOI的病毒液感染细胞。2h后移去全部病毒液，之后补入1ml细胞培养液，分别在24h、48h、72h、96h收集含有BV的上清液，将收集的上清液稀释后，测定BV滴度。图3为TCID
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检测重组病毒AcMNPV
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种gp64
TMdouble
‑
egfp基因，其特征在于序列为SEQ ID No.1。2.一种重组杆状病毒，其特征在于通过转座重组Bac
‑
to
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Bac系统将权利要求1所述的gp64
TMdouble
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egfp基因整合到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV基因组中获得。3.如权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：a)以AcMNPV基因组为模板，扩增gp64基因；b)以gp64基因为模板，通过PCR方法将其中编码跨膜结构域transmembrane domain,TM的序列加倍后获得gp64
TMdouble
；c)构建含有gp64
TMdouble
基因和增强型绿色荧光蛋白egfp基因的重组质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：付月君，王欢，王伟，王软林，宋莉，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：