一种肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，包括以下步骤：S1：用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞；S2：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞；S3：采用无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的单个核细胞；S4：手术切除的肿瘤标本在无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净，并用无菌生理盐水洗3次，并将肿瘤组织剪碎加入RPMI1640培养基内进行充分研磨，研磨后用无菌网过滤后收集单细胞悬液，本肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，采用外周血单个核细胞制备肿瘤抗原靶向性DC细胞，外周血单核细胞最容易获取、数量也最多，因此能使得肿瘤抗原靶向性DC细胞制备效率高，数量多。数量多。数量多。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体为一种肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]DC细胞也称树突状细胞，树突状细胞因其表面具有星状多形性或树枝状突起而得名DC尚无特异性细胞表面分子标志,主要通过形态学、组合性细胞表面标志、在混合淋巴细胞反应中能激活初始T细胞等特征进行鉴定。DC起源自骨髓多能造血干细胞,分化主要有两条途径:
①
髓样干细胞在GM
‑
CSF的刺激下分化为DC,称为髓样DC,也称DC1,与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞；
②
来源于淋巴样干细胞,与T细胞和NK细胞有共同的前体细胞,称为淋巴样DC或浆细胞样DC,即DC2。DC广泛分布于皮肤、气道、淋巴器官等部位,具有高度异质性,故不同组织中的DC有不同的名称，如分布于皮肤表皮基底层和棘细胞之间的DC称为朗格汉斯细胞。DC是机体内功能最强大的抗原提呈细胞，最大的特点是能够刺激初始T细胞进行增殖，DC可以通过多种机制杀伤肿瘤细胞目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，但是手术切除的肿瘤组织往往掺杂了大量的正常组织细胞，抗原浓度很低，因此直接负载DC细胞的效率很差。

技术实现思路

[0003]鉴于现有技术中所存在的问题，本专利技术公开了一种肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：S1：用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞；S2：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞；S3：采用无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的单个核细胞；S4：手术切除的肿瘤标本在无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净，并用无菌生理盐水洗3次，并将肿瘤组织剪碎加入RPMI 1640培养基内进行充分研磨，研磨后用无菌网过滤后收集单细胞悬液；S5：用RPMI 1640培养基重悬细胞至1
‑
2*107/ml，装入5ml无菌冻存管中；S6：将冻存管浸入液氮中速冻，再迅速放入37℃水浴中解冻10min，反复3
‑
5次；S7：将肿瘤裂解物加入离心管中，离心10min，收集上清液，用滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体，并在
‑
80℃冰箱中保存备用；S8：将S3中获得的单个核细胞用无血清培养液调整细胞浓度至2x 106/ml，置于培养瓶内，将培养瓶放入到培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；S9：洗去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入含重组人GM
‑
CSF(500
‑
1000U/ml)和重组人IL
‑
4(500U/ml)的无血清培养液，并放入到培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；S10：每2
‑
3d半量换液一次，并补足细胞因子；S11：在培养的第六天加入重组人TNF
‑
a，IL
‑
1b，IL
‑
6和PGE2，诱导DC细胞成熟，并在24h后收获DC细胞，其数量应达到1
×
106个以上。
[0004]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S1中采集患者自身的外周血单个核细胞容积80
‑
100ml。
[0005]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S4中无菌网的目数为200目。
[0006]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S6中离心机的转速为3000r/min。
[0007]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S6中液氮速冻的时间为10min。
[0008]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S7中滤膜的孔径为0.22mm。
[0009]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S8和S9中培养箱的温度和CO2的浓度分别为37℃和5％。
[0010]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S11中重组人TNF
‑
a的浓度为10ng/ml，IL
‑
1的浓度为10ng/ml，IL
‑
6的浓度为1000U/ml，PGE2的浓度为1mg/ml。
[0011]本专利技术的有益效果：本专利技术采用外周血单个核细胞制备肿瘤抗原靶向性DC细胞，外周血单核细胞最容易获取、数量也最多，因此能使得肿瘤抗原靶向性DC细胞制备效率高，数量多。
附图说明
[0012]图1为本专利技术流程示意图。
具体实施方式
[0013]实施例1
[0014]如图1所示，本专利技术公开了一种肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：S1：用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞；S2：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞；S3：采用无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的单个核细胞；S4：手术切除的肿瘤标本在无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净，并用无菌生理盐水洗3次，并将肿瘤组织剪碎加入RPMI 1640培养基内进行充分研磨，研磨后用无菌网过滤后收集单细胞悬液；S5：用RPMI 1640培养基重悬细胞至1*107/ml，装入5ml无菌冻存管中；S6：将冻存管浸入液氮中速冻，再迅速放入37℃水浴中解冻10min，反复3次；S7：将肿瘤裂解物加入离心管中，离心10min，收集上清液，用滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体，并在
‑
80℃冰箱中保存备用；S8：将S3中获得的单个核细胞用无血清培养液调整细胞浓度至2*106/ml，置于培养瓶内，将培养瓶放入到培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；S9：洗去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入含重组人GM
‑
CSF(500/ml)和重组人IL
‑
4(500U/ml)的无血清培养液，并放入到培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；S10：每2d半量换液一次，并补足细胞因子；S11：在培养的第六天加入重组人TNF
‑
a，IL
‑
1b，IL
‑
6和PGE2，诱导DC细胞成熟，并在24h后收获DC细胞，其数量应达到1
×
106个以上。
[0015]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S1中采集患者自身的外周血单个核细胞容
积80ml。
[0016]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S4中无菌网的目数为200目。
[0017]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S6中离心机的转速为3000r/min。
[0018]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S6中液氮速冻的时间为10min。
[0019]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S7中滤膜的孔径为0.22mm。
[0020]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S8和S9中培养箱的温度和CO2的浓度分别为37℃和5％。
[0021]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S11中重组人TNF
‑
a的浓度为10ng/ml，I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞；S2：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞；S3：采用无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的单个核细胞；S4：手术切除的肿瘤标本在无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净，并用无菌生理盐水洗3次，并将肿瘤组织剪碎加入RPMI1640培养基内进行充分研磨，研磨后用无菌网过滤后收集单细胞悬液；S5：用RPMI1640培养基重悬细胞至1
‑
2*107/ml，装入5ml无菌冻存管中；S6：将冻存管浸入液氮中速冻，再迅速放入37℃水浴中解冻10min，反复3
‑
5次；S7：将肿瘤裂解物加入离心管中，离心10min，收集上清液，用滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体，并在
‑
80℃冰箱中保存备用；S8：将S3中获得的单个核细胞用无血清培养液调整细胞浓度至2*106/ml，置于培养瓶内，将培养瓶放入到培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；S9：洗去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入含重组人GM
‑
CSF(500
‑
1000U/ml)和重组人IL
‑
4(500U/ml)的无血清培养液，并放入到培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；S10：每2
‑
3d半量换液一次，并补足细胞因子；S11...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐子恩，弗莱德，
申请(专利权)人：范德里希上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：