一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法。采用的技术方案是：包括将分离得到的外周血单核细胞移入细胞培养基RPMI

【技术实现步骤摘要】
一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法


[0001]本专利技术属于体外生物学
，涉及一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法。

技术介绍

[0002]NK细胞是一种重要的免疫细胞，具有识别、杀伤某些病毒感染和肿瘤变异细胞的能力。因此，NK细胞在预防和治疗病毒感染和肿瘤方面具有广泛的应用前景。然而，NK细胞的多种功能需要在体外培养后才能展现出来。目前，体外扩增NK细胞的方法主要有两种：一种是利用单核细胞培养基和IL
‑
2诱导NK细胞扩增，但这种方法存在细胞生长的不稳定性和低增殖能力的局限性；另一种是利用细胞工程技术在体外诱导NK细胞扩增，但是这种方法复杂、昂贵，且有一定的风险。
[0003]因此，本专利技术提供一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，该方法简单、安全、易于操作，且能够稳定高效地扩增NK细胞。

技术实现思路

[0004]鉴于现有技术中所存在的问题，本专利技术公开了一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，采用的技术方案是，将分离得到的外周血单核细胞移入细胞培养基中，添加相应的诱导因子，培养48小时，收集细胞，检测NK细胞的扩增情况，其具体方法包含以下步骤：
[0005]步骤一：抽取人体外周血，通过离心机作业，收集外周血单个核细胞PBMCs；
[0006]步骤二：将步骤一得到的PBMCs，再次分离得到单核细胞MNCs；
[0007]步骤三：在细胞培养基中添加诱导因子IL
‑
2、IL
‑/>15、IL
‑
21和IL
‑
18；
[0008]步骤四：将步骤二得到的单核细胞MNCs移入步骤三得到的培养液中，培养24
‑
48小时；
[0009]步骤五：收集步骤四中培养液中的细胞，检测NK细胞的扩增情况。
[0010]作为本专利技术的一种优选方案，步骤三中，所述诱导因子IL
‑
2为50iu/mL，所述诱导因子IL
‑
15为100ng/mL，所述诱导因子IL
‑
21为50ng/mL，所述诱导因子IL
‑
18为100ng/mL。
[0011]作为本专利技术的一种优选方案，所述诱导因子中添加L
‑
Arginine的酶拆分剂AT125，通过采用L
‑
Arginine的酶拆分剂AT125，是为了模拟在某些疾病(如肿瘤、感染等)患者体内或外周血中，L
‑
Arginine的水平显著降低的情况。
[0012]作为本专利技术的一种优选方案，所述细胞培养基为RPMI
‑
1640；采用RPMI
‑
1640培养基中含有还原剂谷胱甘肽和高浓度的维生素、维生素B12以及PABA，用于多种哺乳动物细胞，包括HeLa细胞、Jurkat细胞、MCF
‑
7细胞、PC12细胞、PBMC细胞、星形胶质细胞和癌细胞。
[0013]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤四中的培养环境条件为室温37
°
C和CO2的浓度为5％
‑
8％。
[0014]作为本专利技术的一种优选方案，所述细胞密度为1
×
10^6细胞/mL～1.5
×
10^6细胞/
mL。
[0015]作为本专利技术的一种优选方案，所述检测NK细胞扩增情况采用流式细胞术；流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。流式细胞术(Flow CytoMetry，FCM)是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选，确保实验结果更加准确科学。
[0016]作为本专利技术的一种优选方案，所述外周血单核细胞来源于人体外周血。
[0017]本专利技术的有益效果：本专利技术提供的体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，采用IL
‑
2、IL
‑
15、IL
‑
21以及IL
‑
18作为诱导因子，能够稳定高效地扩增大量的NK细胞，同时，本方法操作简单、成本较低，且不涉及细胞工程技术等复杂操作，便于推广应用。
具体实施方式
[0018]实施例1
[0019]本专利技术所述的一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，采用的技术方案是，包括以下具体实施步骤：
[0020]Step1：收集外周血PBMCs。
[0021]Step2：利用Lympholyte
‑
Mammal(Cedarlane)和无细胞培养基(i.e.RPMI 1640)对PBMCs进行密度梯度离心，分离出单核细胞MNCs。
[0022]Step3：制备诱导因子溶液，将50iu/mL的IL
‑
2、100ng/mL的IL
‑
15、50ng/mL的IL
‑
21和100ng/mL的IL
‑
18分别溶解在细胞培养基中，调整pH值为7.2
‑
7.4。
[0023]Step4：将单核细胞MNCs分装至96孔板中，每孔约含1
×
10^5个细胞，每个孔中加入100μL诱导因子溶液，2个孔一组，重复3组。
[0024]Step5：将96孔板置于室温37℃的孵化箱中，培养72小时，观察细胞生长情况。
[0025]Step6：收集细胞，进行流式细胞术检测NK细胞的扩增情况。
[0026]实施例2
[0027]本专利技术所述的一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，采用的技术方案是在诱导因子中，添加L
‑
Arginine酶拆分剂AT125，模拟在某些疾病(如肿瘤、感染等)患者体内或外周血中，L
‑
Arginine的水平显著降低的情况，包括以下具体实施步骤：
[0028]Step1：浓度梯度离心外周血PBMCs，获得单核细胞MNCs。
[0029]Step2：制备诱导因子溶液，将L
‑
Arginine酶拆分剂AT125加入其中，并调整其浓度为1mM。
[0030]Step3：在96孔板中分装MNCs，分别加入诱导因子和带AT125的诱导因子。
[0031]Step4：将96孔板放置于室温37℃孵化箱中，孵化48小时。
[0032]Step5：取出细胞，测定NK细胞的扩增情况。
[0033]实施例3
[0034]本专利技术所述的一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，用以扩增新生儿外周血单核细胞MNCs中的NK细胞，采用的技术方案是，包括以下具体实施步骤：
[0035]Step1：收集新生儿外周血单核细胞MNCs。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，其特征在于：将分离得到的外周血单核细胞移入细胞培养基中，添加相应的诱导因子，培养48小时，收集细胞，检测NK细胞的扩增情况，其具体方法包含以下步骤：步骤一：抽取人体外周血，通过离心机作业，收集外周血单个核细胞PBMCs；步骤二：将步骤一得到的PBMCs，再次分离得到单核细胞MNCs；步骤三：在细胞培养基中添加诱导因子IL
‑
2、IL
‑
15、IL
‑
21和IL
‑
18；步骤四：将步骤二得到的单核细胞MNCs移入步骤三得到的培养液中，培养24
‑
48小时；步骤五：收集步骤四中培养液中的细胞，检测NK细胞的扩增情况。2.根据权利要求1所述的一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，其特征在于：步骤三中，所述诱导因子IL
‑
2为50iu/mL，所述诱导因子IL
‑
15为100ng/mL，所述诱导因子IL
‑
21为50ng/mL，所述诱导因子I...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐子恩，弗莱德，
申请(专利权)人：范德里希上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：