自然杀伤(NK)细胞组合物及其生成方法技术

本文提供用于自然杀伤(NK)细胞的特化子集的离体扩增的方法，以及含有这样的NK细胞的组合物。还提供用于鉴定或检测NK细胞的特化子集的方法。还提供用于使用所提供的组合物治疗疾病和病症如癌症的方法，包括与能够与疾病相关组织或细胞、如肿瘤细胞或感染的细胞结合的抗体组合。抗体组合。抗体组合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】自然杀伤(NK)细胞组合物及其生成方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年4月22日提交的标题为“自然杀伤(NK)细胞组合物及其生成方法(NATURAL KILLER(NK)CELL COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENERATING SAME)”的美国临时申请号63/014,056的优先权，其内容出于所有目的通过引用以其整体并入。通过引用并入序列表
[0002]本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表以2021年4月21日创建的名为776032000740SeqList.Txt的文件提供，其大小为7,850字节。将电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。


[0003]本公开文本提供用于自然杀伤(NK)细胞的特化子集的离体扩增的方法，以及含有这样的NK细胞的组合物。还提供用于使用本公开文本的组合物治疗疾病和病症如癌症或病毒感染的方法，包括与能够与疾病相关组织或细胞、如肿瘤细胞或感染的细胞结合的抗体组合。

技术介绍

[0004]基于抗体的疗法已经变得常用于治疗癌症和其他疾病。对抗体疗法的反应通常集中于这些抗体对肿瘤细胞的直接抑制作用(例如抑制生长因子受体且随后诱导细胞凋亡)，但是这些抗体的体内作用可能更复杂并且可能涉及宿主免疫系统。自然杀伤(NK)细胞是免疫效应细胞，其在Fc受体(CD16；FcγRIII)与结合至带有抗原的细胞的抗体的Fc部分结合时介导抗体依赖性细胞毒性。NK细胞(包括其特定特化子集)可以用于治疗方法中，包括用于改进对抗体疗法的反应。然而，在细胞疗法如过继细胞疗法中应用NK细胞的主要障碍是其在人外周血中的相对低丰度以及特定特化子集的表面表型特征的缺乏。需要改进的方法用于获得用于治疗性用途的NK细胞组合物。本文提供满足这样的需要的实施方案。

技术实现思路

[0005]本文提供一种用于扩增FcRγ缺陷性NK细胞(g
‑
NK)的方法，所述方法包括：(a)获得富集自然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体是从来自人受试者的生物样品选择的；以及(b)在具有以下的培养基中培养富集的NK细胞的所述群体：(i)辐照的HLA
‑
E+饲养细胞，其中所述饲养细胞缺乏HLA I类和HLA II类并且其中辐照的HLA
‑
E+饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；以及(ii)有效量的用于NK细胞扩增的两种或更多种重组细胞因子，其中至少一种重组细胞因子是白介素(IL)
‑
2并且至少一种重组细胞因子是IL
‑
21；其中所述方法产生富含g
‑
NK细胞的NK细胞的扩增群体。
[0006]本文提供一种用于扩增FcRγ缺陷性NK细胞(g
‑
NK)的方法，所述方法包括：(a)获得富集自然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体是从来自人受试者的生物样品选择的；以及(b)在具有以下的培养基中培养富集的NK细胞的所述群体：(i)
辐照的HLA
‑
E+饲养细胞，其中所述饲养细胞缺乏HLA I类和HLA II类并且其中辐照的HLA
‑
E+饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；以及(ii)有效量的一种或多种重组细胞因子，其中至少一种重组细胞因子是白介素(IL)
‑
21；其中所述方法产生富含g
‑
NK细胞的NK细胞的扩增群体。
[0007]在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者是CMV血清阳性的。
[0008]在一些实施方案中，来自所述受试者的生物样品中NK细胞中g
‑
NK细胞的百分比是大于或大于约5％，任选地其中所述受试者是针对所述生物样品中NK细胞中g
‑
NK细胞的百分比大于或大于约5％选择的受试者。在一些实施方案中，来自所述受试者的生物样品中NK细胞中g
‑
NK细胞的百分比是大于或大于约10％，任选地其中所述受试者是针对所述生物样品中NK细胞中g
‑
NK细胞的百分比大于或大于约10％选择的受试者。在一些实施方案中，来自所述受试者的生物样品中NK细胞中g
‑
NK细胞的百分比是大于或大于约30％，任选地其中所述受试者是针对所述生物样品中NK细胞中g
‑
NK细胞的百分比大于或大于约30％选择的受试者。
[0009]本文还提供一种用于扩增FcRγ缺陷性NK细胞(g
‑
NK)的方法，所述方法包括：(a)选择如下受试者，其中来自所述受试者的外周血样品中至少或至少约20％的自然杀伤(NK)细胞对NKG2C呈阳性(NKG2C
pos
)，并且所述外周血样品中至少70％的NK细胞对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2A
neg
)；(b)从所述受试者获得富集自然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体是从来自所述受试者的生物样品选择的如下细胞：(i)对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD57呈阳性(CD3
neg
CD57
pos
)或者(ii)对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD56呈阳性(CD3
neg
CD56
pos
)；以及(c)在具有辐照的HLA
‑
E+饲养细胞的培养基中培养富集的NK细胞的所述群体，其中所述饲养细胞缺乏HLA I类和HLA II类并且其中辐照的HLA
‑
E+饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1，其中所述培养在用于扩增所述NK细胞的条件下进行；其中所述方法产生富含g
‑
NK细胞的NK细胞的扩增群体。在一些任何前述实施方案中，所述富集NK细胞的群体是从所述生物样品选择的如下细胞：对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD57呈阳性(CD3
neg
CD57
pos
)。在一些任何前述实施方案中，所述富集NK细胞的群体是从所述生物样品选择的如下细胞：对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD56呈阳性(CD3
neg
CD56
pos
)。在一些任何前述实施方案中，所述方法包括further从NK细胞的所述扩增群体选择如下细胞：对NKG2C呈阳性(NKG2C
pos
)和/或对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2A
neg
)。
[0010]本文还提供一种用于扩增FcRγ缺陷性NK细胞(g
‑
NK)的方法，所述方法包括：(a)获得富集自然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体是从来自人受试者的生物样品选择的如下细胞：(i)对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD57呈阳性(CD3
neg
CD57
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于扩增FcRγ缺陷性NK细胞(g
‑
NK)的方法，所述方法包括：(a)获得富集自然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体是从来自人受试者的生物样品选择的；以及(b)在具有以下的培养基中培养富集的NK细胞的所述群体：(i)辐照的HLA
‑
E+饲养细胞，其中所述饲养细胞缺乏HLA I类和HLA II类并且其中辐照的HLA
‑
E+饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；以及(ii)用于扩增所述NK细胞的有效量的两种或更多种重组细胞因子，其中至少一种重组细胞因子是白介素(IL)
‑
2并且至少一种重组细胞因子是IL
‑
21；其中所述方法产生富含g
‑
NK细胞的NK细胞的扩增群体。2.一种用于扩增FcRγ缺陷性NK细胞(g
‑
NK)的方法，所述方法包括：(a)选择如下受试者，其中来自所述受试者的外周血样品中至少或至少约20％的自然杀伤(NK)细胞对NKG2C呈阳性(NKG2C
pos
)，并且所述外周血样品中至少70％的NK细胞对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2A
neg
)；(b)从所述受试者获得富集自然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体是从来自所述受试者的生物样品选择的如下细胞：(i)对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD57呈阳性(CD3
neg
CD57
pos
)或者(ii)对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD56呈阳性(CD3
neg
CD56
pos
)；以及(c)在具有辐照的HLA
‑
E+饲养细胞的培养基中培养富集的NK细胞的所述群体，其中所述饲养细胞缺乏HLA I类和HLA II类并且其中辐照的HLA
‑
E+饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1，其中所述培养在用于扩增所述NK细胞的条件下进行；其中所述方法产生富含g
‑
NK细胞的NK细胞的扩增群体。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括从NK细胞的所述扩增群体选择如下细胞：对NKG2C呈阳性(NKG2C
pos
)和/或对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2A
neg
)。4.一种用于扩增FcRγ缺陷性NK细胞(g
‑
NK)的方法，所述方法包括：(a)获得富集自然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体是从来自人受试者的生物样品选择的如下细胞：(i)对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD57呈阳性(CD3
neg
CD57
pos
)或者(ii)对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD56呈阳性(CD3
neg
CD56
pos
)；(b)在具有辐照的HLA
‑
E+饲养细胞的培养基中培养富集的NK细胞的所述群体，其中所述饲养细胞缺乏HLA I类和HLA II类并且其中辐照的HAL
‑
E+饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1，其中所述培养在用于扩增所述NK细胞的条件下进行；以及(c)从所述扩增群体选择如下NK细胞：对NKG2C呈阳性并且对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2C
pos
NKG2A
neg
)，其中所述方法产生富含g
‑
NK细胞的NK细胞的扩增群体。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中：所述富集NK细胞的群体是针对对NKG2C呈阳性(NKG2C
pos
)的细胞进一步选择的细胞；所述富集NK细胞的群体是针对对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2A
neg
)的细胞进一步选择的细胞；或者所述富集NK细胞的群体是针对对NKG2C呈阳性并且对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2C
pos
NKG2A
neg
)的细胞进一步选择的细胞。
6.一种用于扩增(g
‑
NK)的方法，所述方法包括：(a)获得富集自然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体是从来自人受试者的生物样品选择的如下细胞：对NKG2C呈阳性(NKG2C
pos
)和/或对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2A
neg
)，并且(i)对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD57呈阳性(CD3
neg
CD57
pos
)或者(ii)对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD56呈阳性(CD3
neg
CD56
pos
)；以及(b)在具有辐照的HLA
‑
E+饲养细胞的培养基中培养富集的NK细胞的所述群体，其中所述饲养细胞缺乏HLA I类和HLA II类并且其中辐照的HLA
‑
E+饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1，其中所述培养在用于扩增所述NK细胞的条件下进行；其中所述方法产生富含g
‑
NK细胞的NK细胞的扩增群体。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体是从所述生物样品选择的如下细胞：对NKG2C呈阳性并且对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2C
pos
NKG2A
neg
)。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述受试者是CMV血清阳性的。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中来自所述受试者的生物样品中NK细胞中g
‑
NK细胞的百分比是大于或大于约5％、大于或大于约10％或大于或大于约30％。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中富集的NK细胞的所述群体中g
‑
NK细胞的百分比是在为或约20％与为或约90％之间，是在为或约40％与为或约90％之间，或者是在为或约60％与为或约90％之间。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体是从所述生物样品选择的如下细胞：对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD57呈阳性(CD3
neg
CD57
pos
)。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体是通过如下方法从所述生物样品选择的，所述方法包括：(a)从所述生物样品选择(1)对CD3呈阴性或具有低CD3(CD3
neg
)的细胞或(2)对CD57呈阳性(CD57
pos
)的细胞，从而富集第一选择群体；以及(b)从所述第一选择群体选择以下中的另一种细胞：(1)对CD3呈阴性或具有低CD3(CD3
neg
)的细胞或(2)对CD57呈阳性(CD57
pos
)的细胞，从而富集对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD57呈阳性(CD3
neg
CD57
pos
)的细胞，任选地其中所述方法包括从所述生物样品选择对CD3呈阴性或具有低CD3(CD3
neg
)的细胞，从而富集第一选择群体，以及从所述第一选择群体选择对CD57呈阳性(CD57
pos
)的细胞。13.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体是从所述生物样品选择的如下细胞：对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD56呈阳性(CD3
neg
CD56
pos
)。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体是通过如下方法从所述生物样品选择的，所述方法包括：(a)从所述生物样品选择(1)对CD3呈阴性或具有低CD3(CD3
neg
)的细胞或(2)对CD56呈阳性(CD56
pos
)的细胞，从而富集第一选择群体；以及(b)从所述第一选择群体选择以下中的另一种细胞：(1)对CD3呈阴性或具有低CD3(CD3
neg
)的细胞或(2)对CD56呈阳性(CD56
pos
)的细胞，从而富集对CD3呈阴性或具有低CD3并且对CD56呈阳性(CD3
neg
CD56
pos
)的细胞，任选地其中所述方法包括从所述生物样品选择对CD3呈阴性或具有低CD3(CD3
neg
)的细胞，从而富集第一选择群体，以及从所述第一选择群体选择对CD56呈阳性(CD56
pos
)的细胞。
15.根据权利要求1和3
‑
14中任一项所述的方法，其中所述受试者是针对来自所述受试者的外周血样品中至少或至少约20％的NK细胞对NKG2C呈阳性(NKG2C
pos
)选择的受试者，和/或所述受试者是针对来自所述受试者的外周血样品中至少或至少约70％的NK细胞对NKG2A呈阴性或具有低NKG2A(NKG2A
neg
)选择的受试者。16.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，其中所获得的富集的NK细胞的群体是被冷冻的低温保存的样品，并且在所述培养之前将所述低温保存的样品解冻。17.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，其中在所述培养之前不对所获得的富集的NK细胞的群体进行冷冻或低温保存。18.根据权利要求2
‑
17中任一项所述的方法，其中用于扩增的条件包括有效量的一种或多种重组细胞因子。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子包括有效量的SCF、GSK3i、FLT3、IL
‑
2、IL
‑
6、IL
‑
7、IL
‑
15、IL
‑
12、IL
‑
18、IL
‑
21、IL
‑
27或其组合。20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子包括有效量的IL
‑
2、IL
‑
7、IL
‑
15、IL
‑
12、IL
‑
18、IL
‑
21、IL
‑
27或其组合。21.根据权利要求18
‑
20中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子中的至少一种是IL
‑
21。22.根据权利要求18
‑
21中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子中的至少一种是IL
‑
2。23.根据权利要求1、权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子还包括IL
‑
7、IL
‑
15、IL
‑
12、IL
‑
18或IL
‑
27或其组合。24.根据权利要求1和21
‑
23中任一项所述的方法，其中所述重组细胞因子是IL
‑
21和IL
‑
2。25.根据权利要求1和21
‑
23中任一项所述的方法，其中所述重组细胞因子是IL
‑
21、IL
‑
2和IL
‑
15。26.根据权利要求1和21
‑
25中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间将重组IL
‑
21以为或约10ng/mL至为或约100ng/mL的浓度添加至所述培养基。27.根据权利要求1和21
‑
26中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间将重组IL
‑
21以为或约25ng/mL的浓度添加至所述培养基。28.根据权利要求1和22
‑
27中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间将重组IL
‑
2以为或约10IU/mL至为或约500IU/mL的浓度添加至所述培养基。29.根据权利要求1和22
‑
28中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间将重组IL
‑
2以为或约100IU/mL的浓度添加至所述培养基。30.根据权利要求1和22
‑
28中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间将重组IL
‑
2以为或约500IU/mL的浓度添加至所述培养基。31.根据权利要求23和25
‑
30中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间将重组IL
‑
15以为或约1ng/mL至50ng/mL的浓度添加至所述培养基。32.根据权利要求23和25
‑
31中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间将重组IL
‑
15以为或约10ng/mL的浓度添加至所述培养基。33.根据权利要求1和18
‑
32中任一项所述的方法，其中在为或约所述培养开始时开始
将所述重组细胞因子添加至所述培养基。34.根据权利要求1和18
‑
33中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述培养期间一次或多次更换所述培养基，其中在所述培养基的每次更换时，添加含有所述重组细胞因子的新鲜培养基。35.根据权利要求34所述的方法，其中在所述培养的持续时间中每两或三天进行所述培养基更换。36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中在长达5天不进行培养基更换的初始扩增之后，任选地在长达5天不进行培养基更换的初始扩增之后，更换所述培养基。37.根据权利要求1和18
‑
36中任一项所述的方法，其中所述重组细胞因子包括IL
‑
21并且在所述培养的至少一部分期间作为与抗IL
‑
21抗体的复合物来添加所述IL
‑
21，任选地在为或约所述培养开始时和/或所述培养期间一次或多次添加。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗IL
‑
21抗体的浓度是为或约100ng/mL至500ng/mL，和/或所述重组IL
‑
21的浓度是为或约10ng/mL至100ng/mL。39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述抗IL
‑
21抗体的浓度为或为约250ng/mL，和/或所述重组IL
‑
21的浓度是为或约25ng/mL。40.根据权利要求1
‑
38中任一项所述的方法，其中所述人受试者具有CD16 158V/V NK细胞基因型或CD16 158V/F NK细胞基因型，任选地其中所述生物样品来自针对所述CD16 158V/V NK细胞基因型或所述CD16 158V/F NK细胞基因型选择的人受试者。41.根据权利要求1
‑
40中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包含外周血单个核细胞(PBMC)。42.根据权利要求1
‑
41中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液样品。43.根据权利要求1
‑
42中任一项所述的方法，其中所述生物样品是单采术或白细胞单采术样品。44.根据权利要求1
‑
43中任一项所述的方法，其中所述生物样品是被冷冻的低温保存的样品，并且在所述培养之前将所述低温保存的样品解冻。45.根据权利要求1
‑
43中任一项所述的方法，其中在所述培养之前不对所述生物样品进行冷冻或低温保存。46.根据权利要求1
‑
45中任一项所述的方法，其中所述HLA
‑
E+饲养细胞是K562细胞。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述K562细胞表达膜结合的IL
‑
15(K562
‑
mb15)或膜结合的IL
‑
21(K562
‑
mb21)。48.根据权利要求1
‑
45中任一项所述的方法，其中所述HLA
‑
E+饲养细胞是221.AEH细胞。49.根据权利要求1
‑
48中任一项所述的方法，其中辐照的HLA
‑
E+饲养细胞与NK细胞的比率在1:1与5:1之间，包含端值，或者在1:1与3:1之间，包含端值。50.根据权利要求1
‑
49中任一项所述的方法，其中辐照的HLA
‑
E+饲养细胞与富集的NK细胞的比率为或为约2.5:1或者为或为约2:1。51.根据权利要求50中任一项所述的方法，其中富集的NK细胞的所述群体是新近分离的或者先前尚未进行冷冻和解冻。52.根据权利要求1
‑
49中任一项所述的方法，其中辐照的HLA
‑
E+饲养细胞与富集的NK
细胞的比率为或为约1:1。53.根据权利要求52所述的方法，其中在冷冻用于低温保存之后，已经将富集的NK细胞的所述群体解冻。54.根据权利要求1和18
‑
53中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间添加至所述培养基的所述重组细胞因子为500IU/mL IL
‑
2、10ng/mL IL
‑
15和25ng/mL IL
‑
21。55.根据权利要求1
‑
54中任一项所述的方法，其中富集的NK细胞的所述群体包含在为或约2.0x 105个富集的NK细胞与为或约5.0x 107个富集的NK细胞之间、在为或约1.0x 106个富集的NK细胞与为或约1.0x 108个富集的NK细胞之间、在为或约1.0x 107个富集的NK细胞与为或约5.0x 108个富集的NK细胞之间或者在为或约1.0x 107个富集的NK细胞与为或约1.0x 109个富集的NK细胞之间，每个都包含端值，任选地其中富集的NK细胞的所述群体包含为或约1.0x 106个富集的NK细胞。56.根据权利要求1
‑
55中任一项所述的方法，其中在所述培养开始时的富集的NK细胞的所述群体的浓度为在或在约0.05x 106个富集的NK细胞/mL与1.0x 106个富集的NK细胞/mL之间或者在或在约0.05x 106个富集的NK细胞/mL与0.5x 106个富集的NK细胞/mL之间，任选地其中在所述培养开始时的富集的NK细胞的所述群体包含为或约0.2x 106个富集的NK细胞/mL的浓度。57.根据权利要求1
‑
56中任一项所述的方法，其中所述培养是在封闭系统中进行。58.根据权利要求1
‑
57中任一项所述的方法，其中所述培养是在无菌培养袋中进行。59.根据权利要求1
‑
58中任一项所述的方法，其中所述培养是使用透气性培养器皿来进行。60.根据权利要求1
‑
59中任一项所述的方法，其中所述培养是使用生物反应器来进行。61.根据权利要求1
‑
60中任一项所述的方法，其中进行所述培养直至所述方法实现至少或至少约2.50x 108个g

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：因达普塔治疗公司，
类型：发明
国别省市：