一种NK细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种NK细胞的制备方法。采用的技术方案是：通过培养瓶包被、优化外周血采集、改进提升单个核细胞的分离、接种、扩增和细胞收获步骤，完成NK细胞的制备。本发明专利技术的有益效果：采用自体外周血或者脐血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使NK细胞活化扩增，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的，采用纯因子法培养NK细胞，操作流程简便，不含滋养细胞，有效提升NK细胞制备的纯度和活性，技术成本低，可以进行大规模临床应用。可以进行大规模临床应用。

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞的制备方法


[0001]本专利技术属于血液制品
，涉及一种NK细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]NK细胞是具有自然杀伤功能的天然免疫效应细胞，主要在骨髓微环境中分化、发育，分布于骨髓、外周血、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结。NK细胞不需要特异性抗原刺激，可通过表面受体对“自身”及“非己”进行识别，直接杀伤肿瘤细胞和被病毒感染的靶细胞，是机体对抗病原体和肿瘤细胞的第一道防线。
[0003]目前，现有方法，诱导的NK细胞数量、纯度及活性均不能满足临床应用需求，其制备过程具有较大的改进空间，因此，本专利技术提供一种NK细胞的制备方法，解决以上问题。

技术实现思路

[0004]鉴于现有技术中所存在的问题，本专利技术公开了一种NK细胞的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：
[0005]步骤一：细胞活化瓶预处理一天，用移液管取20mLDPBS加入到60mL的离心管中，取NK试剂A加入DPBS中，拧紧瓶盖上下缓慢颠倒，使A因子充分溶解，将含有A因子的DPBS缓慢加入到200cm2的培养瓶中，拧紧瓶盖，水平放置于台面，记为包被瓶；
[0006]步骤二：将50～100mL的血样，用移液管将血样转移到离心管中，取出5ml的血样进行检菌，室温下，对全血进行离心处理20分钟1800转/min升9降7，离心结束后，用移液管将上层血浆转入离心管，用封口膜封住瓶口避免污染，进行灭活处理；
[0007]步骤三：将步骤二离心后的血浆细胞沉淀，用等体积的生理盐水重悬混匀，将混匀的血细胞缓慢地加到淋巴细胞分离液(Ficoll层)上，确保分层清晰；
[0008]步骤四：用移液管弃去步骤三中的上清液，吸取中层(白膜层)，尽量吸尽两液面交接处的细胞层，将该白膜层放入新的离心管中用生理盐水重悬混匀定容至120mL，此时的悬液即为脐血或者外周血单个核细胞；
[0009]步骤五：将步骤四中的细胞悬液，再次进行离心操作，离心结束后，弃上清，再次清洗细胞沉淀两遍，用手将离心后的细胞沉淀弹散防止其成团，用生理盐水混匀，混匀过程中吸取少量计数；
[0010]步骤六：从冰箱取出步骤一所述的包被瓶，室温放置5
‑
10分钟，配置活化培养基，培养基在使用前需置于室温置于1h；
[0011]步骤七：将步骤六的包被瓶加入步骤五的离心细胞液，将其混合液的浓度调整为1
‑2×
106/mL浓度，并加入体积分数为3
‑
10％的自体或异体血浆，进行NK细胞诱导培养3天；
[0012]步骤八：3天后，将步骤七的原有培养基进行去除，之后进行补液；
[0013]步骤九：此后，每间隔2
‑
3天对步骤八的包被瓶，添加体积分数为所述活化培养基2
‑
3倍的自体或异体血浆，保证细胞浓度为0.6
‑2×
106/mL，进行NK细胞诱导扩增；
[0014]步骤十：培养15天，收取细胞，进行计数和检测。
[0015]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤一中，在进行包被操作时，需要将水平放置的培养瓶，前后左右晃动1
‑
2min，使包被液充分在瓶底分散覆盖，用封口膜封住瓶口，避免污染，放入冰箱4℃冷藏10
‑
12h。
[0016]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤二的血样采用人体外周血或者脐血作为来源，人体外周血为新鲜抽取的血液样本，采样时间在24h以内，脐血为液氮保存时间5
‑
10年的冻存脐带血。
[0017]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤二中的灭火处理过程为，将血浆放入水浴锅56℃灭活半小时，将灭活后的血浆置于4℃的冰箱内，冷却静置0.5h。
[0018]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤六的活化培养基采用NK细胞基础培养基。
[0019]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤五中，离心操作条件为，室温下，外周血作为血浆样本，采用离心处理4
‑
5分钟1500转/min升9降8，脐血作为血浆样本，离心处理8
‑
9分钟1800转/min升9降6。
[0020]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤八至步骤十，培养瓶均置于培养箱中37℃，5％CO2培养。
[0021]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤八至步骤十，从培养箱中取出细胞培养瓶时，应采用水平托盘水平缓移出，避免用手直接操作。
[0022]本专利技术的有益效果：采用自体外周血或者脐血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使NK细胞活化扩增，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的，采用纯因子法培养NK细胞，操作流程简便，不含滋养细胞，有效提升NK细胞制备的纯度和活性，技术成本低，可以进行大规模临床应用。
具体实施方式
[0023]实施例1
[0024]本专利技术所述的一种NK细胞的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：
[0025]步骤一：细胞活化瓶预处理一天，用移液管取20mLDPBS加入到60mL的离心管中，取NK试剂A加入DPBS中，拧紧瓶盖上下缓慢颠倒，使A因子充分溶解，将含有A因子的DPBS缓慢加入到200cm2的培养瓶中，拧紧瓶盖，水平放置于台面，在进行包被操作时，需要将水平放置的培养瓶，前后左右晃动1
‑
2min，使包被液充分在瓶底分散覆盖，用封口膜封住瓶口，避免污染，放入冰箱4℃冷藏10h，记为包被瓶；
[0026]步骤二：将70mL的血样，所述血样采用人体外周血作为来源，人体外周血为新鲜抽取的血液样本，采样时间在24h以内，用移液管将血样转移到离心管中，取出5ml的血样进行检菌，室温下，对全血进行离心处理20分钟1800转/min升9降7，离心结束后，用移液管将上层血浆转入离心管，用封口膜封住瓶口避免污染，进行灭活处理，将血浆放入水浴锅56℃灭活半小时，将灭活后的血浆置于4℃的冰箱内，冷却静置0.5h；
[0027]步骤三：将步骤二离心后的血浆细胞沉淀，用等体积的生理盐水重悬混匀，将混匀的血细胞缓慢地加到淋巴细胞分离液(Ficoll层)上，确保分层清晰；
[0028]步骤四：用移液管弃去步骤三中的上清液，吸取中层(白膜层)，尽量吸尽两液面交接处的细胞层，将该白膜层放入新的离心管中用生理盐水重悬混匀定容至120mL，此时的悬液即为外周血单个核细胞；
[0029]步骤五：将步骤四中的细胞悬液，再次进行离心操作，室温下，外周血作为血浆样本，采用离心处理4
‑
5分钟1500转/min升9降8，离心结束后，弃上清，再次清洗细胞沉淀两遍，用手将离心后的细胞沉淀弹散防止其成团，用生理盐水混匀，混匀过程中吸取少量计数；
[0030]步骤六：从冰箱取出步骤一所述的包被瓶，室温放置10分钟，配置活化培养基，采用NK细胞基础培养基，培养基在使用前需置于室温置于1h；
[0031]步骤七：将步骤六的包被瓶加入步骤五的离心细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：细胞活化瓶预处理一天，用移液管取20mL DPBS加入到60mL的离心管中，取NK试剂A加入DPBS中，拧紧瓶盖上下缓慢颠倒，使A因子充分溶解，将含有A因子的DPBS缓慢加入到200cm2的培养瓶中，拧紧瓶盖，水平放置于台面，记为包被瓶；步骤二：将50～100mL的血样，用移液管将血样转移到离心管中，取出5ml的血样进行检菌，室温下，对全血进行离心处理20分钟1800转/min升9降7，离心结束后，用移液管将上层血浆转入离心管，用封口膜封住瓶口避免污染，进行灭活处理；步骤三：将步骤二离心后的血浆细胞沉淀，用等体积的生理盐水重悬混匀，将混匀的血细胞缓慢地加到淋巴细胞分离液(Ficoll层)上，确保分层清晰；步骤四：用移液管弃去步骤三中的上清液，吸取中层(白膜层)，尽量吸尽两液面交接处的细胞层，将该白膜层放入新的离心管中用生理盐水重悬混匀定容至120mL，此时的悬液即为脐血或者外周血单个核细胞；步骤五：将步骤四中的细胞悬液，再次进行离心操作，离心结束后，弃上清，再次清洗细胞沉淀两遍，用手将离心后的细胞沉淀弹散防止其成团，用生理盐水混匀，混匀过程中吸取少量计数；步骤六：从冰箱取出步骤一所述的包被瓶，室温放置5
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10分钟，配置活化培养基，培养基在使用前需置于室温置于1h；步骤七：将步骤六的包被瓶加入步骤五的离心细胞液，将其混合液的浓度调整为1
‑2×
106/mL浓度，并加入体积分数为3
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10％的自体或异体血浆，进行NK细胞诱导培养3天；步骤八：3天后，将步骤七的原有培养基进行去除，之后进行补液；步骤九：此后，每间隔2
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3天对步骤八的包被瓶，添加体积分数为所述活化培养基2
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐子恩，弗莱德，
申请(专利权)人：范德里希上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：