一种大体积培养的CARNK细胞的收获方法技术

本申请涉及免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种大体积培养的CAR NK细胞的收获方法。收获方法包括：将大体积培养的CAR NK细胞培养物进行连续流离心，得到浓缩后的细胞；连续流离心的离心力为700～900g，转速为200～280rpm；将浓缩后的细胞置换于新鲜培养基中，进行辐照处理，得到辐照后的细胞。本申请方法能够达到细胞治疗产品生产制备阶段全自动和全封闭的要求，且单批次生产规模较大，病人使用的成本显著降低，并且不同批次间差异小，产品质量更可控。可控。可控。

【技术实现步骤摘要】
T到目前为止还是一种“个体化”的细胞治疗产品，细胞培养规模小，培养体积大概仅1
‑
2L左右，一个病人仅制备1
‑
2袋细胞(One Batch
‑
一批次)，不能满足CAR NK细胞治疗产品同种异体的临床使用需求，限制了肿瘤免疫细胞疗法在生物医学领域的大规模推广和临床应用。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种大体积培养的CAR NK细胞的收获方法。该方法能够达到细胞治疗产品生产制备阶段全自动和全封闭的要求，单批次生产规模较大，病人使用的成本显著降低，并且不同批次间差异小，产品质量更可控。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种大体积培养的CAR NK细胞的收获方法，包括如下步骤：
[0010]将大体积培养的CAR NK细胞培养物进行连续流离心，得到浓缩后的细胞；连续流离心的离心力为700～900g，转速为200～280rpm；
[0011]将浓缩后的细胞置换于新鲜培养基中，进行辐照处理，得到辐照后的细胞。
[0012]本专利技术的“大体积培养”是指细胞培养体积在10L及以上。
[0013]作为优选，连续流离心的离心力为750～850g，转速为240～260rpm；
[0014]更优选地，连续流离心的离心力为800g，转速为250rpm。
[0015]采用上述连续流离心技术参数不仅能够维持细胞活率不发生明显改变，还能增加细胞的回收率，回收率能够达到80％以上，细胞损失较小。
[0016]在本专利技术具体实施例中，连续流离心采用连续流离心机进行操作，该设备能实现大体积细胞处理，连续离心，自动控制，省去大量的人力以及“敞口”操作，满足全自动，全封闭的生产工艺需求，对生产环境的要求显著降低。
[0017]作为优选，培养基为NK细胞培养基。
[0018]优选地，培养基为HIPP
TM
‑
T009培养基。
[0019]在本专利技术中，辐照的作用是阻止回输进入人体内的细胞发生过度增殖，产生安全性风险。
[0020]作为优选，辐照的能量源为X射线。
[0021]作为优选，辐照的剂量为10～15Gy。辐照的剂量低于10Gy时，细胞仍然具有增殖能力，存在安全性风险；辐照的剂量高于15Gy时，会导致NK细胞的杀伤活性显著降低。
[0022]作为优选，辐照的剂量率为1.0～1.5Gy/min。
[0023]在本专利技术提供的具体实施例中，辐照的剂量率为1.225Gy/min。
[0024]在本专利技术提供的具体实施例中，辐照的时间为490～735s。
[0025]作为优选，浓缩后的细胞在培养基中的密度为105～108cells/mL。
[0026]在本专利技术提供的具体实施例中，浓缩后的细胞在培养基中的密度为8
×
105～4
×
107cells/mL。
[0027]在本专利技术提供的实施方式中，辐照处理之后还包括如下步骤：
[0028]对辐照后的细胞进行冻存制剂置换；
[0029]将所得冻存制剂中的细胞进行梯度降温，冻存。
[0030]在本专利技术提供的具体实施例中，冻存制剂置换的参数包括：
[0031]2个循环(Cycles)，母液体积2L，细胞压缩体积(PCV)为6.5，终体积为4.5～7.5L
(具体根据辐照后的活细胞总数设定)；
[0032]循环1(Cycle 1)的微旋流滤柱进液端进液流量(Spinner inlet Flow Rate)为120mL/min，微旋流滤柱出液端出液流量(Reduction Retentate Flow Rate)为6mL/min；
[0033]循环2(Cycle 2)的微旋流滤柱进液端进液流量(Spinner inlet Flow Rate)为100mL/min，微旋流滤柱出液端出液流量(Reduction Retentate Flow Rate)为10mL/min，出液端微旋流滤柱离心转速(Reduction Spinner Rev Rate)为3000rpm，目标产品稀释体积(IP Dilution Volume)为500mL。
[0034]上述冻存制剂置换的参数可根据置换效果进行调整，并非限定于此。
[0035]作为优选，细胞在冻存制剂中的密度为106～108cells/mL。
[0036]优选地，细胞在冻存制剂中的密度为107～108cells/mL。
[0037]在本专利技术提供的具体实施例中，细胞在冻存制剂中的密度为2
×
107cells/mL。
[0038]作为优选，梯度降温的程序为：
[0039](1)4℃平衡；
[0040](2)以1℃/min的降温速率，将样本温度降至
‑
13℃；
[0041](3)以25℃/min的降温速率，将腔体温度降至
‑
50℃；
[0042](4)以10℃/min的升温速率，将腔体温度升至
‑
23℃；
[0043](5)以1℃/min的降温速率，将腔体温度降至
‑
40℃；
[0044](6)以10℃/min的降温速率，将样本温度降至
‑
90℃。
[0045]作为优选，冻存的温度为
‑
80℃～
‑
196℃。
[0046]在本专利技术提供的具体实施例中，冻存的温度为液氮温度。
[0047]与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果为：
[0048]本专利技术采用连续流离心技术，在特定的离心参数下，不仅能够维持细胞活率不发生明显改变，还能增加细胞的回收率，回收率能够达到80％以上，CAR NK细胞损失较小。
[0049]本专利技术采用10～15Gy的辐照剂量，可有效阻止回输进入人体内的细胞发生过度增殖，产生安全性风险，同时还可以最大限度的维持CAR NK细胞的杀伤活性。
[0050]本专利技术采用特定的降温程序对细胞进行冻存，能够很好地保护细胞产品的在降温凝固过程中的放热过程，保证细胞在降温过程中处于较好的休眠状态，复苏后的细胞仍然具有较高的细胞活率和对肿瘤细胞的杀伤活性，满足货架型细胞治疗产品的制备要求。
[0051]本专利技术方法能够确保CAR NK细胞的下游制备工艺从“手动到全自动”，从“敞口到全封闭”操作方式的转变，能够满足监管机构对细胞治疗产品生产制备阶段需要达到全自动和全封闭的要求。
[0052]本专利技术细胞产品制备过程，单批次生产规模较大，病人使用的成本显著降低，并且不同批次间差异小，产品质量更可控。
[0053]本专利技术方法制备的CAR NK细胞产品在液氮中稳定保存半年以上，可以满足同种异体病人的临床使用需求，真正实现将免疫细胞治疗产业从“个体化治疗技术”向“off
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大体积培养的CAR NK细胞的收获方法，其特征在于，包括如下步骤：将大体积培养的CAR NK细胞培养物进行连续流离心，得到浓缩后的细胞；所述连续流离心的离心力为700～900g，转速为200～280rpm；将浓缩后的细胞置换于新鲜培养基中，进行辐照处理，得到辐照后的细胞。2.根据权利要求1所述的收获方法，其特征在于，所述连续流离心的离心力为750～850g，转速为240～260rpm；更优选地，所述连续流离心的离心力为800g，转速为250rpm。3.根据权利要求1所述的收获方法，其特征在于，所述辐照的能量源为X射线。4.根据权利要求3所述的收获方法，其特征在于，所述辐照的剂量为10～15Gy。5.根据权利要求3所述的收获方法，其特征在于，所述辐照的剂量率为1.0～1.5Gy/min。6.根据权利要求1所述的收获方法，其特征在于，所述浓缩后的细胞在培养基中的密度为105～108cells/mL。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的收获方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华顺，夏颖，刘刚，
申请(专利权)人：苏州因特药物研发有限公司，
类型：发明
国别省市：