一种NK-92细胞的电转染方法技术

本申请涉及细胞转染技术领域，具体涉及一种NK

【技术实现步骤摘要】
一种NK
‑
92细胞的电转染方法


[0001]本申请涉及细胞转染
，具体涉及一种NK
‑
92细胞的电转染方法。

技术介绍

[0002]电穿孔是指通过施加一个刚好超过细胞膜电容的外加电场，可以诱导细胞膜瞬间和可逆的击穿，核酸等物质可以通过这些临时孔来进入细胞，其是一种适用于多种细胞类型的瞬时和稳定转染的物理转染方法。此外，由于电穿孔简单快速，一旦确定了最佳电穿孔条件，它就能够在短时间内转染大量细胞。电穿孔的主要缺点是由高压脉冲引起的大量细胞死亡和仅部分成功的膜修复。与其他转染方法相比，需要使用更多数量的细胞，并且需要根据不同细胞类型调整电转染参数以及实验条件。
[0003]NK
‑
92细胞是一种白细胞介素
‑
2(IL
‑
2)依赖性自然杀伤细胞系，来源于50岁的白人男性，患有快速进展的非霍奇金淋巴瘤的外周血单核细胞。在癌症、免疫学和毒理学研究中经常使用NK
‑
92细胞。该细胞系是一个合适的转染宿主，且对多种恶性细胞具有细胞毒性：它在铬释放测定中杀死K562细胞和Daudi细胞。NK
‑
92细胞(经辐照后防止增殖)可有效用于血液中白血病的免疫离体清除，而不会影响造血细胞功能。
[0004]目前，现有的NK
‑
92编辑方法是基于CRISPR/Cas9系统，通过电穿孔的物理转染方式将带有核定位序列的Cas9蛋白以及和目的基因对应的sgRNA所形成的RNP复合物转入细胞中，并通过sgRNA中的PAM序列识别到目标位点之后进行目的基因的敲除。常采用的NK
‑
92细胞系电转染参数包括：360V，20ms；300V，70ms双次脉冲，且两次脉冲之间间隔一分钟。常采用的NK
‑
92细胞系电转染实验条件包括：在20μL电转体系中需要2.0
‑
3.0
×
106个细胞，50pmol NLS
‑
SpCas9
‑
EGFP蛋白和100pmol sgRN A，电转后静置时间为5min。以该电转染参数以及实验条件对NK
‑
92细胞系进行电转时，电转染的阳性率仅有10％。且经多次实验得知，基因敲除比例仅为转染阳性率的30％，对于获得基因敲除的单克隆细胞株来说较为困难。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种NK
‑
92细胞的电转染方法。该方法在保证电转后细胞活率的同时，使用更少的NK
‑
92细胞数，以获得更高的转染效率以及编辑效率。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种NK
‑
92细胞的电转染方法，包括如下步骤：
[0008]步骤(1)：将外源基因载体、NK
‑
92细胞与电转染缓冲液混合，得到电转染体系；
[0009]步骤(2)：对NK
‑
92细胞进行电击，电击为单次脉冲，单次脉冲的电压为500～580V，单次脉冲的时间为15～25ms；
[0010]步骤(3)：将电击后的NK
‑
92细胞静置，然后进行细胞培养。
[0011]作为优选，单次脉冲的电压为540V，单次脉冲的时间为20ms。
[0012]作为优选，NK
‑
92细胞在电转染体系中的细胞密度为(5～7.5)
×
104cells/μL。
[0013]优选地，NK
‑
92细胞在电转染体系中的细胞密度为(5～6)
×
104cells/μL。
[0014]更优选地，NK
‑
92细胞在电转染体系中的细胞密度为5
×
104cells/μL。
[0015]作为优选，电转染体系为15～25μL。
[0016]优选地，电转染体系为20μL。
[0017]作为优选，NK
‑
92细胞在20μL电转染体系中的细胞数目为(1.0～1.5)
×
106。
[0018]优选地，NK
‑
92细胞在20μL电转染体系中的细胞数目为1.0
×
106。
[0019]在本专利技术提供的具体实施例中，外源基因载体包括敲除目的基因的载体和/或转入目的基因的载体。
[0020]作为优选，敲除目的基因的载体为Cas9/sgRNA核糖核蛋白；
[0021]作为优选，转入目的基因的载体为含有目的基因的质粒。
[0022]作为优选，外源基因载体为Cas9/sgRNA核糖核蛋白，步骤(1)为：
[0023]将Cas9蛋白、sgRNA和电转缓冲液制成混合溶液，经第一孵育，得到含有Cas9/sgRNA核糖核蛋白的混合物；
[0024]将NK
‑
92细胞和含有Cas9/sgRNA核糖核蛋白的混合物混合，经第二孵育，得到电转染体系。
[0025]作为优选，在混合溶液中，Cas9蛋白的添加量为2～3pmol/μL；
[0026]优选地，Cas9蛋白的添加量为2.5pmol/μL。
[0027]作为优选，在混合溶液中，sgRNA的添加量为6～9pmol/μL；
[0028]优选地，sgRNA的添加量为7.5pmol/μL。
[0029]作为优选，第一孵育的温度为15～30℃，时间为2～10min。
[0030]优选地，第一孵育的温度为室温，时间为5～10min；
[0031]作为优选，第二孵育的温度为15～30℃，时间为5～15min。
[0032]优选地，第二孵育的温度为室温，时间为10min。
[0033]作为优选，静置的温度为36～38℃，时间为5～10min。
[0034]优选地，静置的温度为37℃，时间为5min。
[0035]与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果为：
[0036]1、可提高NK
‑
92细胞系在电穿孔转染后的存活率：
[0037]本专利技术研究发现电穿孔(电转染)中电击脉冲次数、电压、脉冲时间、静置时间等参数对于被电击后NK
‑
92细胞活率的影响较大，通过特定的脉冲次数、电压、脉冲时间、静置时间等参数，不仅缩短了电击时间，而且提高NK
‑
92细胞系在电穿孔转染后的存活率，从而可降低电转染所需细胞数。
[0038]现有的NK
‑
92细胞系电转染的常规方案，在20μL电转体系中需要2.0
‑
3.0
×
106个细胞，电转完当天细胞活率达到80％左右，电穿孔转染后24h细胞活率为85％，电转染48h后细胞活率上升，最高可恢复至95％左右。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK
‑
92细胞的电转染方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)：将外源基因载体、NK
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92细胞与电转染缓冲液混合，得到电转染体系；步骤(2)：对NK
‑
92细胞进行电击，所述电击为单次脉冲，所述单次脉冲的电压为500～580V，所述单次脉冲的时间为15～25ms；步骤(3)：将电击后的NK
‑
92细胞静置，然后进行细胞培养。2.根据权利要求1所述的电转染方法，其特征在于，所述单次脉冲的电压为540V，所述单次脉冲的时间为20ms。3.根据权利要求1所述的电转染方法，其特征在于，所述NK
‑
92细胞在电转染体系中的细胞密度为(5～7.5)
×
104cells/μL；优选地，所述NK
‑
92细胞在电转染体系中的细胞密度为(5～6)
×
104cells/μL。4.根据权利要求1所述的电转染方法，其特征在于，所述电转染体系为15～25μL。5.根据权利要求1所述的电转染方法，其特征在于，所述外源基因载体包括敲除目的基因的载体和/或转入目的基因的载体；所述敲除...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘婉琳，张骏，阙红，李华顺，
申请(专利权)人：苏州因特药物研发有限公司，
类型：发明
国别省市：