一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法，属于生物医药技术领域，主要是将提取的肿瘤淋巴细胞TILs在第一溶液中培养，收集细胞，将收集的细胞与饲养层细胞在第二溶液中进行培养，收获干细胞样记忆性宫颈癌TILs，所述饲养层细胞是由基因工程化Hela细胞处理获得，所述基因工程化Hela细胞株为表达跨膜的细胞因子IL

【技术实现步骤摘要】
一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法。

技术介绍

[0002]宫颈癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，目前最佳的防控策略是早期筛查和疫苗接种，但由于我国人口基数大，区域发展不平衡，筛查和疫苗接种没有全面普及，宫颈癌的发病率仍然很高。而免疫治疗特别是细胞免疫治疗可以调节机体免疫功能，改变肿瘤微环境(TME)，诱导特异性肿瘤免疫，达到治疗宫颈癌、减少宫颈癌复发和转移的目的，已经成为继手术、化疗、放疗后的第四种治疗方式。
[0003]基于肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes，TILs)的过继免疫治疗也越来越受到国内外学者的关注。TILs是从肿瘤组织中分离出来的肿瘤抗原特异性淋巴细胞群，含有T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞。研究表明在治疗转移性黑色素瘤、乳腺癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌等实体瘤中取得良好疗效，这充分显示出TILs用于治疗实体瘤的潜力。然而，国内外上关于TILs在治疗宫颈癌的临床研究比较少。
[0004]目前在TILs提取和培养上主要是在Rosenberg教授研究基础上的改良。在TILs提取上，主要步骤就是把肿瘤组织剪成碎块，使用胶原酶消化成单细胞悬液，接着用淋巴细胞分离液进行不连续梯度密度离心提纯出TILs。在获取单细胞悬液这一步也有学者使用组织块培养法(寡克隆培养法)、细穿刺抽吸培养法等。在TILs培养上，Rosenberg使用的快速扩增方案(Redpid explantion protocal，REP)，又叫二步法，即第一步，加入一定剂量的IL
‑
2，让TILs扩增到一定数量，接着第二步，细胞转入含有抗CD3单克隆抗体(OKT3)、IL
‑
2以及经辐射灭活的健康供者的外周血单个核细胞(PBMC)中培养，实现进一步扩增。
[0005]肿瘤抗原特异性记忆T细胞(memory T cells)是一类具有抗肿瘤作用的T细胞亚型，当再次遇到同样抗原时能够产生快速且更强的抗肿瘤免疫应答。记忆T细胞通过是否表达CCR7、CD45RA可分为干细胞样记忆性T细胞(Tscm)(CCR7+CD45RA+)、中央型记忆性T细胞(Tcm)(CCR7+CD45RA
‑
)、效应记忆性T细胞(Tem)(CCR7
‑
CD45RA
‑
)、效应T细胞(Teff)(CCR7
‑
CD45RA+)。值得注意的是，Tscm不仅能维持自我更新，在抗原的再次刺激分化为Tcm和Tem，临床前研究发现将Tscm、Tcm、Tem荷瘤小鼠输注后，Tscm组肿瘤缩小程度最大，Tcm次之，Tem则最弱。这表明离体扩增出更高比例的Tscm、有助于TILs发挥更持久更有效的作用。
[0006]因此，开发一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌TILs的方法，以获得可供临床治疗应用的TILs，对宫颈癌的治疗具有重要意义。
[0007]中国专利文献CN114686430A(申请号：202011629408.7)公开了一种制备TIL的方法，其主要内容对含TIL细胞的初始细胞群与饲养层feeder细胞进行共培养后得到含扩增的TIL细胞的第一扩增细胞群，然后将所述第一扩增细胞群与第二feeder细胞进行共培养获得含扩增的TIL细胞的第二扩增细胞群。该专利虽然能够从极少量的易获取的肿瘤样本
的X
‑
vivo
TM
15培养基。
[0024]根据本专利技术优选的，步骤(2)中，所述第二溶液的配方包括：体积分数为10％人AB血清、30ng/ml IL
‑
2的X
‑
vivo
TM
15培养基。
[0025]根据本专利技术优选的，步骤(3)中，所述饲养层细胞是由基因工程化Hela细胞经过辐照获得。
[0026]进一步优选的，取基因工程化Hela细胞进行辐照40Gy，获得饲养层细胞。
[0027]上述基因工程化Hela细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0028]①
将上述跨膜的细胞因子IL
‑
7、跨膜的细胞因子IL
‑
15、跨膜的细胞因子IL
‑
21插入相应载体构建pLV[Exp]‑
Hygro
‑
EF1A
‑
IL
‑
7质粒、pLV[Exp]‑
Neo
‑
EF1A
‑
IL
‑
15质粒、pLV[Exp]‑
Puro
‑
EF1A
‑
IL
‑
21质粒，采用慢病毒包装试剂盒分别转染293T细胞包装成三种慢病毒，即表达IL
‑
7慢病毒、表达IL
‑
15慢病毒、表达IL
‑
21慢病毒；
[0029]②
将表达IL
‑
7慢病毒转染Hela细胞株、并采用Hygro抗生素筛选获得稳定表达IL
‑
7Hela细胞株；然后将表达IL
‑
15慢病毒转染稳定表达IL
‑
7Hela细胞株、并采用Neo抗生素筛选获得稳定表达IL
‑
7和IL
‑
15Hela细胞株；最后将表达IL
‑
21慢病毒转染稳定表达IL
‑
7和IL
‑
15Hela细胞株，并采用Puro抗生素筛选获得稳定表达IL
‑
7、IL
‑
15和IL
‑
21Hela细胞株，即为基因工程化Hela细胞株(Hela
‑
rhIL
‑
7/15/21)。
[0030]有益效果
[0031]1、本专利技术解决了TILs体外培养周期长，扩增倍数低且抗瘤活性低的技术难题。
[0032]2、本专利技术提供的TILs扩增方法，经过14天的体外培养，TILs增殖倍数达到2000倍以上，干细胞样性记忆细胞占比超过90％，体外细胞杀伤率以及体内肿瘤体积抑制率均达到90％以上，本专利技术提供的TILs扩增方法，培养周期短、杀伤力强，具有很高的临床应用价值。
附图说明
[0033]图1为pLV[Exp]‑
Hygro
‑
EF1A
‑
IL
‑
7质粒图。
[0034]图2为pLV[Exp]‑
Neo
‑
EF1A
‑
IL
‑
15质粒图。
[0035]图3为pLV[Exp]‑
Puro
‑
EF1A
‑
IL
‑
21质粒图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从宫颈癌肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs；(2)将步骤(1)提取的肿瘤淋巴细胞TILs在第一溶液中培养，培养时间为2～5天，培养后收集细胞，所述第一溶液的配方包括：体积分数为10％人AB血清、50～150ng/ml CD3激动剂、50～150ng/ml CD28激动剂、50～150ng/ml CD137激动剂、5～50ng/ml IL
‑
2的X
‑
vivo
TM
15培养基；(3)将步骤(2)收集的细胞与饲养层细胞在第二溶液中进行培养，细胞与饲养层细胞的细胞数比例为1:(1～3)，培养时间为10
‑
13天，收获干细胞样记忆性宫颈癌TILs；所述饲养层细胞是由基因工程化Hela细胞处理获得；所述第二溶液的配方包括：体积分数为10％人AB血清、5～50ng/ml IL
‑
2的X
‑
vivo
TM
15培养基；所述基因工程化Hela细胞株为表达跨膜的细胞因子IL
‑
7、IL
‑
15，IL
‑
21的细胞株(以下简称Hela
‑
rhIL
‑
7/15/21)；所述跨膜的细胞因子IL
‑
7包括：CD8α信号肽、IL
‑
7、CD8α跨膜区，并按顺序连接，核苷酸序列如SEQ ID NO.4；所述跨膜的细胞因子IL
‑
15包括：CD8α信号肽、IL
‑
15、CD8α跨膜区，并按顺序连接，核苷酸序列如SEQ ID NO.6；所述跨膜的细胞因子IL
‑
21包括：CD8α信号肽、IL
‑
21、CD8α跨膜区，并按顺序连接，核苷酸序列如SEQ ID NO.8。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一溶液的配方包括：体积分数为10％人AB血清、100ng/ml CD3激动剂、100ng/ml CD28激动剂、100ng/ml CD137激动剂、30ng/ml IL
‑
2的X
‑
vivo
TM
15培养基。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁少帅，曹启龙，韩国英，张松梅，王芝辉，徐娟，董友玉，张文茜，
申请(专利权)人：青岛海尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：