一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法技术

本发明专利技术属于抗肿瘤细胞制备领域，具体涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：(1)将组织用消化液消化，过滤，收集单细胞悬液，离心，加入分离液，离心，取淋巴细胞；(2)将淋巴细胞接种至培养瓶中，培养；(3)培养至第4日，添加rIL

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法


[0001]本专利技术属于抗肿瘤细胞制备领域，具体涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]癌症是严重危害人类健康的重大疾病。传统的治疗方法包括手术、放疗、化疗等多种方式，对部分患者有一定疗效，但总体治疗效果并不理想。免疫治疗是新兴的肿瘤治疗方式，已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式，在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。
[0003]肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor
‑
infiltrating lymphocytes，TIL)是一种浸润在肿瘤组织里面能够有效识别肿瘤细胞新抗原的T细胞。具有能够高效杀死肿瘤细胞的能力，包括杀死由该病灶转移到其他部位的肿瘤细胞。
[0004]TIL疗法作为过继性免疫治疗的方法之一，对恶性肿瘤的治疗有着广泛的应用前景。TIL疗法是利用肿瘤中已经存在的肿瘤反应性T细胞，从患者自身的肿瘤组织(或腹水)中分离出来，在体外激活和扩增后重新输入患者体内，因其较强的杀瘤活性和靶向特异性，成为癌症生物免疫治疗的热点。
[0005]过继细胞转移治疗依赖于可靠的和可复制的方法产生肿瘤反应T淋巴细胞。作为将TIL治疗应用于临床的第一步，产生最佳肿瘤反应性足够数量的TIL是必不可少的。TILs细胞数量与病人的预后间存在相关性，在肿瘤组织内TILs高者预后更好，FOXP3+Tregs对生存率有负面影响。
[0006]TILs细胞实际上属于异质细胞群，包括T细胞、B细胞和NK细胞，但主要为CD3+T细胞，而CD3+T细胞可进一步分化成为CD8+的细胞毒T细胞(CTL)、记忆性T细胞(Tm)、辅助性T细胞(Th)。不同病人来源或不同组织来源的TILs细胞中各种细胞类型存在明显差异。提高CD8+的细胞毒T细胞(CTL)数量和比例是关键。高水平的CD8+、CD3+和CD4+TILs对提高患者总生存率和阻止复发都有预后意义。
[0007]高比例的CD8+T细胞和高数量的注入TILs是应答患者的特征。输注产品中CD8+T细胞的百分比与临床反应以及输注细胞数量与临床反应之间的关系已明确。
[0008]化疗和放疗的疗效有限，目前有治愈潜力的治疗方法需使用高剂量的白细胞介素IL
‑
2和干扰素IFN
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α。
[0009]建立和扩增TIL培养的复杂程序，高剂量IL
‑
2的毒性也限制了这种治疗的实施。体外扩增需要高剂量的IL
‑
2，但IL
‑
2过高会导致培养的TIL中FOXP3+Treg数量增加，FOXP3+Tregs对生存率有负面影响。同时后续给患者回输的时候也必须要辅助注射高剂量的IL
‑
2来维持这些细胞在体内的活性，引起不良反应。因此IL
‑
2的剂量应控制在合适的范围内。
[0010]中国专利CN113577265A公开了一种产品，其为用于治疗肺癌的药物组合，由转基因的TIL细胞以及CTLA
‑
4单克隆抗体和培美曲塞组成，所述TIL细胞采用如下方法制备获得：将新鲜肺癌肿瘤组织置于含抗生素的冷Hanks
’
液中浸泡30min，去除坏死、出血及脂肪组织，称重，剪成小块，加入消化酶液中消化，再加入透明质酸酶和DNA酶，完全消化后的组
织过120目铜网，将分离的TIL在含10％人AB血清的RPMI1640完全培养基中培养，并加入IL
‑
2，同时加OKT3和VC，孵箱培养，共培养20d，即得到目的TIL细胞。本专利技术提供了一种有效分离并制备的肿瘤浸润淋巴细胞，将所述细胞转TNF
‑
α高表达后与制备的CTLA
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4单克隆抗体和培美曲塞一起使用能够显著的抑制肺癌肿瘤的增殖，具有较好的效果。
[0011]目前的方案培养时间过长，因此需要研发新的方法缩短培养时间(获得年轻TIL)，同时增加输注TILs的肿瘤反应性：添加一些细胞因子或抗体可能增强肿瘤细胞的免疫原性，从而增加TIL产品中能够杀死肿瘤细胞的肿瘤特异性T细胞的比例。

技术实现思路

[0012]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，进一步提高肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞扩增的成功率。
[0013]本专利技术技术方案包括：
[0014]一方面，本专利技术提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0015](1)将组织用消化液消化，过滤，收集单细胞悬液，离心，加入分离液，离心，吸取淋巴细胞；
[0016](2)将淋巴细胞接种至培养瓶中，培养；
[0017](3)培养至第4日，添加rIL
‑
2、rIL
‑
15、OKT3、OK432、抗4
‑
1BB抗体继续培养，收获肿瘤浸润淋巴细胞。
[0018]优选地，所述步骤(1)中消化液选自胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶IV、透明质酸酶V、DNase、无酚红胰蛋白酶中的一种或多种。
[0019]进一步优选地，所述步骤(1)中消化液为胶原酶IV、透明质酸酶V和DNase组合使用。
[0020]再进一步优选地，所述胶原酶IV的浓度为0.01
‑
0.5mg/mL；
[0021]更进一步优选地，所述胶原酶IV的浓度为0.1mg/mL；
[0022]再进一步优选地，所述透明质酸酶V的浓度为0.005
‑
0.05mg/mL；
[0023]更进一步优选地，所述透明质酸酶V的浓度为0.01mg/mL；
[0024]再进一步优选地，所述DNase的浓度为5
‑
15U/mL；
[0025]更进一步优选地，所述DNase的浓度为10U/mL。
[0026]具体的，所述胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、
Ⅴ
型以及肝细胞专用胶原酶，胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量68
‑
130KD，能消化多种组织。
[0027]具体的，所述透明质酸酶V是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。
[0028]具体的，所述DNase是指脱氧核糖核酸酶，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。
[0029]具体的，所述胰蛋白酶是胰腺分泌的一种水解酶，能水解由肽链相连的氨基酸类化合物，具有酯酶活性。
[0030]优选地，所述步骤(1)中消化的温度为35
‑
40℃；
[0031]进一步优选地，所述步骤(1)中消化的温度为37℃。
[0032]优选地，所述步骤(1)中消化的时间为60
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)将组织用消化液消化，过滤，收集单细胞悬液，离心，加入分离液，离心，吸取淋巴细胞；(2)将淋巴细胞接种至培养瓶中，培养；(3)培养至第4日，加入rIL
‑
2、rIL
‑
15、OKT3、OK432、抗4
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1BB抗体继续培养，收获肿瘤浸润淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中消化液选自胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶IV、透明质酸酶V、DNase、无酚红胰蛋白酶中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中消化液为胶原酶IV、透明质酸酶V和DNase组合使用；所述胶原酶IV的浓度为0.01
‑
0.5mg/mL；所述透明质酸酶V的浓度为0.005
‑
0.05mg/mL；所述DNase的浓度为5
‑
15U/mL。4.根据权利要求1所述的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡向兵，姬云，
申请(专利权)人：苏州科为康生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：