外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，包括：准备细胞培养瓶；向外周血自然杀伤细胞中加入基础培养基重悬细胞后吸出，再添加至所述细胞培养瓶中，并加入人重组IL

【技术实现步骤摘要】
外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法


[0001]本专利技术涉及体外扩增领域，尤其涉及一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤已成为我国主要死亡原因之一，目前尚无理想的治疗方式。近年来，免疫细胞治疗在血液肿瘤中取得的成功，受到广大研究者的青睐。自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)，即NK细胞是一种淋巴细胞亚群，具有抵抗病原微生物和消除癌细胞的能力，而不受MHC限制，通过产生溶酶颗粒和干扰素γ发挥功能。NK细胞过继免疫疗法是很有前途的恶性肿瘤治疗邻域，多项临床研究表明，对某些癌症患者具备良好的安全性和初步疗效。
[0003]随着NK细胞的需求日益增多，如何提高NK细胞体外培养扩增数量是目前最为关键的问题。NK细胞培养面临着诸多问题，如：高纯度的细胞难以用于体外扩增培养及滋养细胞(辐照后的癌细胞系)刺激NK细胞扩增，但滋养细胞的加入带来产品不稳定性及安全性问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其能够稳定地大量体外扩增外周血自然杀伤细胞，并且过程中能够有效减少细胞碎片的形成。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
[0006]S1、准备细胞培养瓶；
[0007]S2、按第一细胞浓度向外周血自然杀伤细胞中加入基础培养基重悬细胞后吸出，再添加至所述细胞培养瓶中，并加入人重组IL
‑
>2，人重组IL
‑
15和胎牛血清，开始培养；
[0008]S3、培养至第2天
‑
3天时，开始向培养体系中补加培养液，所述培养液包括人重组IL
‑
2，人重组IL
‑
15，胎牛血清和L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯，维持细胞总浓度在第二细胞浓度内并继续培养；
[0009]S4、当所述细胞培养瓶内培养液的体积超过预设体积时，将所述细胞培养瓶内的细胞转移至细胞培养袋中继续培养；
[0010]S5、随后的2
‑
7天内，每2
‑
3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.9
‑
1.1倍体积的所述培养液并继续培养；
[0011]S6、随后的1
‑
7天内，每2
‑
3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.4
‑
0.6倍体积的所述培养液并继续培养；
[0012]S7、培养至第20
‑
23天时，收集所有细胞，完成培养。
[0013]在一种实施方式中，所述培养液中，所述人重组IL
‑
2的浓度为900IU/ml
‑
1100IU/ml；
[0014]所述人重组IL
‑
15的浓度为9ng/ml
‑
11ng/ml；
[0015]所述胎牛血清的体积浓度为0.9％
‑
6％；
[0016]所述L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯的浓度为15ug/ml
‑
55ug/ml。
[0017]优选地，所述培养液中，所述人重组IL
‑
2的浓度为1000IU/ml；
[0018]所述人重组IL
‑
15的浓度为10ng/ml；
[0019]所述胎牛血清的体积浓度为1％
‑
5％；
[0020]所述L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯的浓度为50ug/ml。
[0021]在一种实施方式中，步骤S2中，所述人重组IL
‑
2的浓度为900IU/ml
‑
1100IU/ml；
[0022]所述人重组IL
‑
15的浓度为9ng/ml
‑
11ng/ml；
[0023]所述胎牛血清的体积浓度为9％
‑
11％。
[0024]优选地，步骤S2中，所述人重组IL
‑
2的浓度为1000IU/ml；
[0025]所述人重组IL
‑
15的浓度为10ng/ml；
[0026]所述胎牛血清的体积浓度为10％。
[0027]在一种实施方式中，所述第一细胞浓度为2
×
106cells/ml
‑
2.5
×
106cells/ml
[0028]所述第二细胞浓度为0.9
×
106cells/ml
‑
1.1
×
106cells/ml；
[0029]所述第三细胞浓度为1.9
×
106cells/ml
‑
2.1
×
106cells/ml；
[0030]所述预设体积为190ml
‑
210ml。
[0031]在一种实施方式中，步骤S1中，所述准备细胞培养瓶由下述方法完成：
[0032]取无菌T175，在底面加入4ml
‑
6ml磷酸缓冲盐溶液润湿瓶底，再加入Lymactin
‑
NK抗体1ml
‑
2ml，轻柔混匀后放入培养箱中孵育至少4小时。
[0033]在一种实施方式中，所述外周血自然杀伤细胞的获得方法包括以下步骤：
[0034]外周血分离得到单核细胞；
[0035]所述单核细胞纯化后得到外周血自然杀伤细胞。
[0036]在一种实施方式中，所述外周血分离得到单核细胞，包括以下步骤：
[0037]采集外周血血样，将采集的血样平均分装至离心管中，离心后，吸弃上层血浆，保留下层血细胞层；
[0038]加入生理盐水混匀血细胞，在新取的离心管中加入分层液，将稀释后的血细胞缓慢加入至分层液上，再进行离心；
[0039]离心后收集第二层白膜层细胞，分别缓慢加入到离心管中，再加入生理盐水后离心，弃上清，得到单核细胞。
[0040]在一种实施方式中，所述单核细胞采用下述方法完成纯化：
[0041]对单核细胞进行二步磁珠分选，分选后细胞计数，离心吸弃多余上清。
[0042]实施本专利技术，具有如下有益效果：
[0043]本专利技术提供的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，通过在培养过程中引入特定组分的培养液，使得体外培养外周血自然杀伤细胞时能够能提高NK细胞的扩增倍数，同时能够有效减少细胞碎片的形成。
附图说明
[0044]图1为实施例1培养至第21天时自然杀伤细胞的倒置显微镜观察图；
[0045]图2为对比例1培养至第21天时自然杀伤细胞的倒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、准备细胞培养瓶；S2、按第一细胞浓度向外周血自然杀伤细胞中加入基础培养基重悬细胞后吸出，再添加至所述细胞培养瓶中，并加入人重组IL
‑
2，人重组IL
‑
15和胎牛血清，开始培养；S3、培养至第2天
‑
3天时，开始向培养体系中补加培养液，所述培养液包括人重组IL
‑
2，人重组IL
‑
15，胎牛血清和L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯，维持细胞总浓度在第二细胞浓度内并继续培养；S4、当所述细胞培养瓶内培养液的体积超过预设体积时，将所述细胞培养瓶内的细胞转移至细胞培养袋中继续培养；S5、随后的2
‑
7天内，每2
‑
3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.9
‑
1.1倍体积的所述培养液并继续培养；S6、随后的1
‑
7天内，每2
‑
3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.4
‑
0.6倍体积的所述培养液并继续培养；S7、培养至第20
‑
23天时，收集所有细胞，完成培养。2.如权利要求1所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述培养液中，所述人重组IL
‑
2的浓度为900IU/ml
‑
1100IU/ml；所述人重组IL
‑
15的浓度为9ng/ml
‑
11ng/ml；所述胎牛血清的体积浓度为0.9％
‑
6％；所述L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯的浓度为15ug/ml
‑
55ug/ml。3.根据权利要求2所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述培养液中，所述人重组IL
‑
2的浓度为1000IU/ml；所述人重组IL
‑
15的浓度为10ng/ml；所述胎牛血清的体积浓度为1％
‑
5％；所述L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯的浓度为50ug/ml。4.根据权利要求1所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤S2中，所述人重组IL

【专利技术属性】
技术研发人员：冯嘉昆，吴远武，刘小翠，魏丽梅，唐淑艳，许峻荣，
申请(专利权)人：广东唯泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：