一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法及应用，通过对肿瘤组织进行消化分离，获得的细胞给予连续刺激并使用特定培养基进行定向诱导扩增培养，在细胞达到一定数量后使用磁珠进行分选，对获得的特异性杀伤细胞继续扩增，直到细胞数量满足多次使用后冻存，对冻存细胞进行复苏，经过10天左右时间培养即可获得满足制剂需求的细胞数量并制成细胞悬液。本发明专利技术采用连续刺激加定向培养的扩增方式，在细胞接种初始即给予刺激，相比传统培养方法先无差别扩增种子细胞再定向刺激的方式，可大大提高细胞扩增效率。使用磁珠分选，对特异性杀伤细胞进一步提纯，再大规模扩增，可使细胞维持高水平的生物活性，1次冻存的种子细胞能够满足4

【技术实现步骤摘要】
一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及T淋巴细胞制剂领域，特别涉及一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]近几年，随着生物医药领域的迅猛发展，免疫疗法逐渐成为继手术、放疗、化疗后第四类肿瘤治疗手段，其中过继性细胞治疗、免疫检查点阻断疗法、肿瘤疫苗以及双特异性抗体等治疗方法均取得了一定的临床疗效。然而在实体瘤发展过程中，实体肿瘤的物理屏障及其复杂的肿瘤微环境限制了非特异性免疫治疗的疗效。
[0003]来自肿瘤内部或肿瘤组织附近的肿瘤组织浸润性淋巴细胞，对肿瘤细胞具有特异性识别能力，在1922年首次被提到，Mac carty推测淋巴细胞到肿瘤组织内是体内免疫系统抵抗肿瘤的一种现象，提出了肿瘤组织浸润性淋巴细胞是一种高效抗癌的免疫效应细胞。1986年Rosenberg等人在荷瘤小鼠的肿瘤组织内发现并分离出了肿瘤组织浸润性淋巴细胞，他们将分离出的细胞经过体外扩增培养后，再回输到荷瘤小鼠体内，发现肿瘤组织有明显消退，从而证明肿瘤组织浸润性淋巴细胞具有抗肿瘤的作用。
[0004]常规的肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞培养方法，多采用两步法进行培养，先用高浓度的IL
‑
2扩增细胞数量，再用CD3单抗、CD28单抗或辐照的人外周血PBMC等对细胞进行刺激以提高效应细胞的比例，培养周期通常在20
‑
25天，也有研究培养到36天，此方法最后收获的细胞，往往生物活性均有所降低，杀伤性细胞比例偏低，最终制剂中含有较高比例的调节性T淋巴细胞，严重影响临床治疗效果。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是，提供了一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法及应用，可大大提高具有特异性识别肿瘤抗原的细胞比例，免磁珠残留，确保制剂细胞品质。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0007]S1.将手术后废弃的肿瘤组织进行清洗、分割，放入消化液中震荡消化30
‑
40min；
[0008]S2.组织消化后过滤、洗涤、离心，用T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到预先包被的培养瓶中，补加IFN
‑
γ至终浓度1000
‑
1500IU/ml，进行细胞培养；
[0009]S3.每日观察细胞状态，取样计数，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3
‑
0.8)
×
109/L，继续细胞培养；
[0010]S4.继续每日观察细胞状态，当培养体系达到10
‑
15ml时，取样计数，将细胞转移至预先包被的培养瓶中；根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3
‑
0.8)
×
109/L，补加IFN
‑
γ至终浓度1000
‑
1500IU/ml，继续细胞培养；
[0011]S5.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到25
‑
45ml时，将细胞转入另
一培养瓶中，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3
‑
0.8)
×
109/L，继续细胞培养；
[0012]S6.继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到1
×
108时，使用CD4磁珠对细胞进行分选，所得阴选细胞重新接种至培养瓶中，调整细胞浓度在(0.3
‑
0.8)
×
109/L，补加T淋巴细胞完全培养基继续培养；
[0013]S7.继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到(1.0
‑
2.0)
×
108时，将细胞按照(2.5～4.0)
×
107个细胞/支，冻存4
‑
6支，程控降温后冻存于
‑
196℃液氮罐中；
[0014]S8.复苏1支细胞，接种到预先包被的培养瓶中，补加IFN
‑
γ至终浓度1000
‑
1500IU/ml，补加T淋巴细胞完全培养基继续培养；
[0015]S9.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到180
‑
200ml时，将细胞转入细胞培养袋中，按照20
‑
50ng/ml向培养袋中补加CD3和CD28单抗，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3
‑
0.8)
×
109/L，继续细胞培养；
[0016]S10.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到1600
‑
2000ml且细胞总数在4
‑6×
109以上时，收获全部细胞。
[0017]所述预先包被的培养瓶的方法为：用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃，5.0％ CO2条件下0.5
‑
1h。
[0018]步骤S1中，每立方厘米组织块加入10
‑
15ml消化液。
[0019]步骤S1中，消化液为含有0.075
‑
0.15g/ml的Ⅰ型胶原酶的1640培养基。
[0020]T淋巴细胞完全培养基为含有体积浓度10％～20％胎牛血清、体积浓度2％50X氨基酸和4000～6000IU/ml IL
‑
2的X
‑
VIVO 15培养基。
[0021]CD3和CD28两种单抗的含量为20～50ng/cm2。
[0022]上述的制备方法制得的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞在制备肿瘤特异性药物中的应用。
[0023]上述制备方法制备得到的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞。
[0024]一种肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂，包括上述的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞。
[0025]本专利技术的有益效果是：本专利技术从含有大量具有特异性识别肿瘤抗原的免疫细胞的肿瘤组织及其周围组织中分离获得种子细胞，经体外定向培养，进一步分选，可大大提高具有特异性识别肿瘤抗原的细胞比例，并且此类细胞主要为杀伤性T细胞，进入到人体除自身发挥抗肿瘤作用外，还可分泌多种细胞因子，积极调动人体免疫系统协同进行肿瘤杀伤。本专利技术选用CD4磁珠阴选的分选方式，能够有效降低调节性T细胞出现在细胞制剂中的可能，还可以避免磁珠残留，确保制剂细胞品质。分选后对细胞继续扩增，再进行冻存，能够最大限度保持冻存细胞的活性和稳定性，切实满足多次制剂回输需求，为治疗效果提供保障。
附图说明
[0026]图1是本专利技术实施例1D3镜下观察细胞扩增状态图(4倍镜)；
[0027]图2是本专利技术实施例1培养D9天细胞分选前流式结果图；
[0028]图3是本专利技术实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将手术后废弃的肿瘤组织进行清洗、分割，放入消化液中震荡消化30
‑
40min；S2.组织消化后过滤、洗涤、离心，用T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到预先包被的培养瓶中，补加IFN
‑
γ至终浓度1000
‑
1500IU/ml，进行细胞培养；S3.每日观察细胞状态，取样计数，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3
‑
0.8)
×
109/L，继续细胞培养；S4.继续每日观察细胞状态，当培养体系达到10
‑
15ml时，取样计数，将细胞转移至预先包被的培养瓶中；根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3
‑
0.8)
×
109/L，补加IFN
‑
γ至终浓度1000
‑
1500IU/ml，继续细胞培养；S5.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到25
‑
45ml时，将细胞转入另一培养瓶中，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3
‑
0.8)
×
109/L，继续细胞培养；S6.继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到1
×
108时，使用CD4磁珠对细胞进行分选，所得阴选细胞重新接种至培养瓶中，调整细胞浓度在(0.3
‑
0.8)
×
109/L，补加T淋巴细胞完全培养基继续培养；S7.继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到(1.0
‑
2.0)
×
108时，将细胞按照(2.5～4.0)
×
107个细胞/支，冻存4
‑
6支，程控降温后冻存于
‑
196℃液氮罐中；S8.复苏1支细胞，接种到预先包被的培养瓶中，补加IFN
‑
γ至终浓度1000

【专利技术属性】
技术研发人员：韩颢，韩洪起，王小宇，冯春玲，吴学涛，陈晓波，
申请(专利权)人：优赛生命科学发展有限公司，
类型：发明
国别省市：