【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞工程，具体是指一种使用脐带血制备通用型nk细胞公共库、nk细胞制剂及其制备方法。
技术介绍
1、nk细胞是免疫系统的重要组成部分，对靶细胞的识别与杀伤不受mhc限制，不需抗原预先致敏就可以直接杀伤同系、同种、异种肿瘤细胞及被病毒感染的靶细胞。nk细胞主要通过以下途径发挥杀伤作用：(1)通过释放细胞质内的穿孔素和颗粒酶调控凋亡。细胞毒性颗粒中含有的穿孔素被释放到nk细胞和肿瘤细胞间的裂隙，可破坏肿瘤细胞膜，使丝氨酸蛋白酶进入细胞内，并造成细胞内大分子物质流出，导致靶细胞溶解。(2)死亡受体介导的靶细胞凋亡。nk细胞表达fas配体，通过与肿瘤细胞表面相应死亡受体结合而将其杀死。(3)细胞因子介导的杀伤作用。活化的nk细胞能分泌多种细胞因子，如tnf、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子、il-15、il-10、il-13等。通过分泌的细胞因子来抑制肿瘤细胞的增殖以及杀伤肿瘤细胞。
2、大量临床实验证明，自体nk细胞治疗在肿瘤治疗中虽有一定的治疗效果，且无明显毒副作用，但杀瘤效果有限，因为nk细胞上的杀伤性免疫球蛋白样受体(kir)与肿瘤细胞上的mhcⅰ类分子相匹配，从而阻断了nk细胞的激活。为了克服这类限制，采用异体来源的nk细胞进行肿瘤过继性免疫治疗的研究越来越多。异体nk细胞种子来源主要有四种，①外周血来源的nk细胞：外周血中的成熟nk细胞是目前大部分非基因修饰nk细胞产品的主要细胞来源，但因其含量较少，仅占循环淋巴细胞的5-15％，并不是通用型nk的首选来源。②脐带血来源的nk细胞：因其取材方便，无伦理问
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种通用型nk细胞公共库、nk细胞制剂及其制备方法，需患者提供种子细胞，减少患者痛苦，且制剂制备周期较短。
2、本专利技术是这样实现的，一种通用型nk细胞公共库的制备方法，包括以下步骤：
3、(1)配置完全培养基：培养基中含有体积比浓度10％-20％的胎牛血清和终浓度400-600iu/ml的白细胞介素2；
4、(2)分离脐血单个核细胞(ubmc)：将50-100ml脐带血样本按照血液样本体积：氯化钠注射液体积比等于1：1的比例进行样本稀释后，再以血液样本稀释液体积：淋巴细胞分离液体积等于2：1的比例将血液样本加入到淋巴细胞分离液中，以离心力300-500g低速离心20-25分钟，回收白膜层细胞，以50-100ml氯化钠注射液清洗一遍后用完全培养基重悬细胞，按照(4-5)×105个细胞/ml的浓度将最终获得的脐带血单个核细胞接种至t182细胞培养瓶中；
5、(3)金属浴复苏滋养层细胞(apc)，按照ubmc：apc＝1：1-2的数量比例，将apc接种至步骤(2)的培养瓶中，混匀后放入37℃、5％co2培养箱培养；
6、(4)nk种子库制备：每日观察细胞状态，每间隔48h取细胞悬液计数，根据细胞计数结果补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.4-0.6)×109个细胞/l，置于37℃，5.0％ co2培养箱进行连续培养；当培养至7-10天，细胞总数达到(2-4)×108个细胞时，取(2-5)×106个细胞进行流式检测，检测nk细胞表面标志物cd3-cd16+/cd56+的表达量，当比例达到80％以上，计算纯nk细胞数量，按照(1-2)×106个cd3-cd16+/cd56+细胞/ml进行nk细胞种子库冻存。
7、上述的制备方法制得的通用型nk细胞公共库。
8、采用上述制备的通用型nk细胞公共库制备通用型nk细胞制剂的方法，包括以下步骤：
9、(1)脐血nk细胞制剂制备：金属浴复苏4-8支权利要求1制备的nk种子库细胞，按照(2.5-5)×104个细胞/ml浓度接种至t182细胞培养瓶中，金属浴复苏apc，按照nk种子细胞数：apc＝1：2-4的比例加入到含nk种子细胞的t182细胞培养瓶中，置于37℃，5.0％ co2培养箱进行连续培养；
10、(2)第一次补液：间隔48-72h取100-200ul细胞悬液计数，根据细胞计数结果补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.8-1.2)×109个细胞/l，置于37℃，5.0％ co2培养箱继续培养；
11、(3)第二次补液：间隔48-72h取100-200ul细胞悬液计数，补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.8-1.2)×109个细胞/l，置于37℃，5.0％ co2培养箱继续培养；
12、(4)第7-10天，细胞浓度达到(2-4)×109个细胞/l时，回收全部细胞。
13、如上述制备方法制得的通用型nk细胞制剂。
14、本专利技术具有的优点和技术效果：本专利技术采用单次分离50-100ml脐带血获得的淋巴细胞，使用滋养层细胞经过7-10天体外扩增，根据表面标志物检测结果，计算nk细胞数量并冻存得到通用型nk细胞种子库，将种子细胞与滋养层细胞按照精确比例共培养7-10天，即可得到纯度大于90％的nk细胞制剂。本专利技术采用二次扩增的方式，首先制备nk种子库，再将种子库细胞进行短期扩增培养，即可得到纯度高，质量优的nk细胞制剂，此方法仅需要少量脐带血，最终细胞制剂即可获得(1-3)×1012个nk细胞，可满足1000人次的用量。区别于传统nk细胞制剂单次制备单次采血的问题，该方法无需患者提供种子细胞，减少患者痛苦，且制剂制备周期较短，可根据不同需求同时制备多种规格细胞制剂，使用更加灵活便捷，制剂细胞纯度高，批次间品质稳定可控。
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1.一种通用型NK细胞公共库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法制得的通用型NK细胞公共库。
3.采用权利要求1制备的通用型NK细胞公共库制备通用型NK细胞制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.如权利要求3所述制备方法制得的通用型NK细胞制剂。
【技术特征摘要】
1.一种通用型nk细胞公共库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法制得的通用型nk细胞公共库。
3.采用...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩颢，王欣言，韩洪起，冯春玲，吴学涛，孙超凡，姚蕾，
申请(专利权)人：优赛生命科学发展有限公司，
类型：发明
国别省市：
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