【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种靶向kras g12位点突变抗原的ctl的制备方法。
技术介绍
1、癌基因ras是首个被发现的人类癌基因，主要有kras，hras和nras 3种亚型。ras突变引发的癌症约占人类癌症的30％，而kras基因突变占ras基因突变总数的85％(nras占12％，hras占3％)，kras也被誉为癌症治疗的“靶点之王”。在kras的基因突变中基因点突变多达3000种，exon2第11，12，13，61和59位密码子多见，研究表明超过80％的kras突变发生在12密码子，其主要发生突变形式为g12s、g12v、g12r、g12d、g12c、g12a。正常时，kras蛋白通过gdp/gtp之间的转换来控制下游信号通路，但发生突变的kras蛋白不再依靠上级信号刺激即可一直与gtp处于持续结合状态，使得下游的信号通路活跃异常，促进肿瘤细胞的生长与增殖。在过去几年中，对一线治疗未能奏效或已停药的kras抗原突变阳性癌症患者而言，临床治疗选择相当有限，仅有kras g12c突变的靶向药上市，存在较高的医疗需求缺口。
2、近年来，人们已经逐渐认识到免疫系统在肿瘤的发生、发展及治疗等方面的关键作用，免疫治疗已然成为继手术、放疗、化疗、靶向治疗后的第五大疗法，具有巨大的治疗潜力。已有研究证实癌抗原特异性t细胞免疫治疗在肾细胞癌、胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌等恶性实体肿瘤及恶性血液肿瘤的辅助治疗中显示出了较好的疗效及安全性。目前主要有两种方法制备癌抗原特异性t细胞，一是通过中国专利文献(申请号：cn2
3、目前制备kras突变抗原特异性免疫效应细胞的方法存在制备周期长、制备的kras突变抗原特异性免疫效应细胞只能识别1-3个kras高频突变或者杀伤效果低等问题较多弊端，开发一种快速扩增靶向kras g12位点突变抗原的hla-a*02:01限制性ctl的方法显得至关重要，这将为临床上携带kras g12位点突变恶性肿瘤患者治疗提供一种非常重要的治疗手段。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种靶向kras g12位点突变抗原的ctl的制备方法。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种负载kras g12位点突变抗原肽刺激细胞的制备方法，包括如下步骤：
4、①将跨膜型cxcl10基因插入相应载体构建plv[exp]-hygro-ef1a-cxcl10质粒，采用慢病毒包装试剂盒包装成慢病毒，即表达跨膜型cxcl10慢病毒；
5、所述跨膜型cxcl10基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；
6、②将表达跨膜型cxcl10慢病毒转染t2细胞，筛选获得稳定表达跨膜型cxcl10的t2细胞；
7、③将稳定表达跨膜型cxcl10 t2细胞进行辐照，细胞辐照量80-120gy，辐照密度为(2.5-3.5)×106/ml；
8、④取辐照后稳定表达跨膜型cxcl10 t2细胞，按照细胞密度(0.8-1.2)×106/ml接种于rpmi-1640培养基，并添加β2微球蛋白3-8μg/ml，kras g12位点突变抗原肽8-12μm，进行培养，获得负载kras g12位点突变抗原肽刺激细胞；
9、所述kras g12位点突变抗原肽为：
10、kras g12s突变抗原肽，氨基酸序列为klvvvgasgv seq id no.7；
11、kras g12v突变抗原肽，氨基酸序列为klvvvgavgv seq id no.8；
12、kras g12r突变抗原肽，氨基酸序列为klvvvgargv seq id no.9；
13、kras g12d突变抗原肽，氨基酸序列为klvvvgadgv seq id no.10；
14、kras g12c突变抗原肽，氨基酸序列为klvvvgacgv seq id no.11；
15、或kras g12a突变抗原肽，氨基酸序列为klvvvgaagv seq id no.12。
16、根据本专利技术优选的，步骤①中，采用慢病毒包装试剂盒分别转染293t细胞包装成慢病毒。
17、根据本专利技术优选的，步骤②中，将表达跨膜型cxcl10慢病毒以moi＝10转染t2细胞、并采用潮霉素b筛选获得稳定表达跨膜型cxcl10的t2细胞。
18、根据本专利技术优选的，步骤③中，细胞辐照量100gy，辐照密度为3×106/ml。
19、根据本专利技术优选的，步骤④中，按照细胞密度1.0×106/ml接种于rpmi-1640培养基。
20、根据本专利技术优选的，步骤④中，添加β2微球蛋白5μg/ml，kras g12位点突变抗原肽10μm。
21、根据本专利技术优选的，步骤④中，进行培养是置于37℃，5％的co2条件下培养2h，1200rpm离心收集细胞。
22、一种靶向kras g12位点突变抗原的hla-a*02:01限制性ctl的制备方法，包括如下步骤：
23、(1)第0天(分离获得单个核细胞的当天作为0天)，采集hla-a*02:01型健康供者外周血，分离出初始cd8+t细胞；
24、(2)将步骤(1)分离的初始cd8+t细胞按照细胞密度(0.4-0.6)×106cells/ml接种到含体积分数为10％ab血清、30-300iu/ml il-2、3-30ng/ml il-12、30-300ng/ml cd28抗体的x-vivotm15培养基中，并添加1/3-1倍数量的上述方法制备的负载kras g12位点突变抗原肽刺激细胞，进行培养；
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1.一种负载KRAS G12位点突变抗原肽刺激细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤①中，采用慢病毒包装试剂盒分别转染293T细胞包装成慢病毒。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤②中，将表达跨膜型CXCL10慢病毒以MOI＝10转染T2细胞、并采用潮霉素B筛选获得稳定表达跨膜型CXCL10的T2细胞。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤③中，细胞辐照量100Gy，辐照密度为3×106/mL。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤④中，按照细胞密度1.0×106/mL接种于RPMI-1640培养基；
6.一种靶向KRAS G12位点突变抗原的HLA-A*02:01限制性CTL的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，采用人初始CD8+T细胞分选试剂盒分离出初始CD8+T细胞。
8.如权利要求6所述的制备方
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)或(4)中，培养基中CD28抗体的浓度为200ng/mL。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)或(5)中，培养基中IL-2的浓度为200IU/mL、IL-12的浓度为10ng/mL；
...【技术特征摘要】
1.一种负载kras g12位点突变抗原肽刺激细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤①中，采用慢病毒包装试剂盒分别转染293t细胞包装成慢病毒。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤②中，将表达跨膜型cxcl10慢病毒以moi＝10转染t2细胞、并采用潮霉素b筛选获得稳定表达跨膜型cxcl10的t2细胞。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤③中，细胞辐照量100gy，辐照密度为3×106/ml。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤④中，按照细胞密度1.0×106/ml接种于rpmi-1640培养基；
6.一种靶向kras g12...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹启龙，韩国英，朱钰婷，况斐，黄伟，梁少帅，王芝辉，
申请(专利权)人：青岛海尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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