一种外周血单个核细胞的提取收集方法技术

本发明专利技术涉及一种外周血单个核细胞的提取收集方法。采用的技术方案是：采用Ficoll离心法提取外周血单个核细胞，加入D

【技术实现步骤摘要】
一种外周血单个核细胞的提取收集方法


[0001]本专利技术属于细胞提取
，涉及一种外周血单个核细胞的提取收集方法。

技术介绍

[0002]分离外周血单个核细胞(PBMC)是临床科研的常规工作，Ficoll离心法作为主要分离单个核细胞的方法，通过不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带，从而获取目的细胞。理想状态下，Ficoll离心法获取单个核细胞的得率为80
‑
90％，细胞纯度可达到90％以上。但实际操作中，由于抗凝剂的影响，未能得到充足的血液样品而导致实验效果不佳，同时，经过多次离心操作，外周血单个核细胞的增值能力得到损伤，导致提取到的外周血单个核细胞的活性不佳。
[0003]因此，本专利技术提供一种外周血单个核细胞的提取收集方法，通过探究不同抗凝剂的使用以及加入增加活性的物质，对分离提取单个核细胞的影响，来提高单个核细胞的增值能力，提高分离提取的成活率，解决以上问题。

技术实现思路

[0004]鉴于现有技术中所存在的问题，本专利技术公开了一种外周血单个核细胞的提取收集方法，采用的技术方案是，包含以下步骤：
[0005]步骤一：取正常人体外周血加入抗凝剂，制得新鲜抗凝全血20ml；
[0006]步骤二：将抗凝全血加入到50ml的离心管内，离心处理待其静置分层后，用吸管吸取上层血浆层，获得下层沉淀细胞液；
[0007]步骤三：在步骤二获得的下层沉淀细胞液中，加入D
‑
Hanks溶液，混匀混合，制成细胞悬液；
[0008]步骤四：另取一支离心管加入Ficoll淋巴细胞分层液，用吸管吸取步骤三的细胞悬液，并将其缓慢均匀加注在Ficoll淋巴细胞分层液的上层，使得步骤三的细胞悬液浮于Ficoll淋巴细胞分层液之上，然后调整离心机转速为1800
‑
2000r/min，离心20min，静置分层，得到分层细胞液；
[0009]步骤五：将步骤四中得到的分层细胞液，用吸管吸取最上层的血浆层，待血浆层下降至距离单个核细胞上层1mm处，改用毛细吸管吸取剩余的血浆层，直至将其吸完，该过程保持环境温度为4
‑
6度；
[0010]步骤六：另取一毛细吸管和离心管，将步骤五的单个核细胞层尽量吸完注入离心管内，然后加入D
‑
Hanks溶液或者PBS液，然后进行离心处理；
[0011]步骤七：在步骤六中得到的离心液，静置分层后，用毛细吸管吸取上清液，之后加入微小核糖核酸溶液，低温4
‑
6度，静置8
‑
15min；
[0012]步骤八：将步骤七得到的细胞悬液，再次进行离心处理，调整离心机转速为1800r/min，离心时间为25min，吸取上层清液，收集底部沉淀，即可得到单个核细胞，取样检测单个
核细胞的数目及活率。
[0013]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤一采用的抗凝剂为肝素和EDTA的混合液。
[0014]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤二的离心处理过程为，调整离心机转速为2000
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2500r/min，离心20
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30min。
[0015]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤三加入的D
‑
Hanks溶液的体积与步骤二获得的下层沉淀细胞液体积之比为：1:1
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1.5:1。
[0016]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤四中，加入的Ficoll淋巴细胞的体积与细胞悬液的体积与之比为1.2：1。
[0017]作为本专利技术的一种优选方案，所述D
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Hanks溶液或者PBS液的体积为所述步骤五的单个核细胞层的体积的3
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6倍。
[0018]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤六的离心处理过程为，调整离心机转速为1400r/min，离心15min。
[0019]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤七中加入的微小核糖核酸溶液，采用甘草分离提取制备。
[0020]本专利技术的有益效果：通过采用肝素和EDTA的及混合液作为抗凝剂，加入甘草制备的微小核糖核酸，能够进一步提高单个核细胞的增值能力，提高单个核细胞分离提取的活性。
具体实施方式
[0021]实施例1
[0022]本专利技术所述的一种外周血单个核细胞的提取收集方法，采用的技术方案，包含以下步骤：
[0023]步骤一：取正常人体外周血加入肝素和EDTA的及混合液作为抗凝剂，制得新鲜抗凝全血20ml；
[0024]步骤二：将抗凝全血加入到50ml的离心管内，调整离心机转速为2000
‑
2500r/min，离心20
‑
30min，离心处理待其静置分层后，用吸管吸取上层血浆层，获得下层沉淀细胞液；
[0025]步骤三：在步骤二获得的下层沉淀细胞液中，加入D
‑
Hanks溶液，其体积与步骤二获得的下层沉淀细胞液体积之比为：1:1
‑
1.5:1，混匀混合，制成细胞悬液；
[0026]步骤四：另取一支离心管加入Ficoll淋巴细胞分层液，其体积与细胞悬液的体积与之比为1.2：1，用吸管吸取步骤三的细胞悬液，并将其缓慢均匀加注在Ficoll淋巴细胞分层液的上层，使得步骤三的细胞悬液浮于Ficoll淋巴细胞分层液之上，然后调整离心机转速为1800
‑
2000r/min，离心20min，静置分层，得到分层细胞液；
[0027]步骤五：将步骤四中得到的分层细胞液，用吸管吸取最上层的血浆层，待血浆层下降至距离单个核细胞上层1mm处，改用毛细吸管吸取剩余的血浆层，直至将其吸完，该过程保持环境温度为4
‑
6度；
[0028]步骤六：另取一毛细吸管和离心管，将步骤五的单个核细胞层尽量吸完注入离心管内，然后加入3
‑
6倍体积的D
‑
Hanks溶液或者PBS液，然后进行离心处理，调整离心机转速为1400r/min，离心15min；
[0029]步骤七：在步骤六中得到的离心液，静置分层后，用毛细吸管吸取上清液，之后加
入甘草分离提取制备的微小核糖核酸溶液，低温4
‑
6度，静置8
‑
15min；
[0030]步骤八：将步骤七得到的细胞悬液，再次进行离心处理，调整离心机转速为1800r/min，离心时间为25min，吸取上层清液，收集底部沉淀，即可得到单个核细胞，取样检测单个核细胞的数目及活率。
[0031]所述步骤八中，单位取样体积内的单个核细胞的成活率为95.4％。
[0032]实施例2
[0033]本专利技术所述的一种外周血单个核细胞的提取收集方法，采用的技术方案，包含以下步骤：
[0034]步骤一：取正常人体外周血加入肝素或者EDTA的一种作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外周血单个核细胞的提取收集方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤一：取正常人体外周血加入抗凝剂，制得新鲜抗凝全血20ml；步骤二：将抗凝全血加入到50ml的离心管内，离心处理待其静置分层后，用吸管吸取上层血浆层，获得下层沉淀细胞液；步骤三：在步骤二获得的下层沉淀细胞液中，加入D
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Hanks溶液，混匀混合，制成细胞悬液；步骤四：另取一支离心管加入Ficoll淋巴细胞分层液，用吸管吸取步骤三的细胞悬液，并将其缓慢均匀加注在Ficoll淋巴细胞分层液的上层，使得步骤三的细胞悬液浮于Ficoll淋巴细胞分层液之上，然后调整离心机转速为1800
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2000r/min，离心20min，静置分层，得到分层细胞液；步骤五：将步骤四中得到的分层细胞液，用吸管吸取最上层的血浆层，待血浆层下降至距离单个核细胞上层1mm处，改用毛细吸管吸取剩余的血浆层，直至将其吸完，该过程保持环境温度为4
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6度；步骤六：另取一毛细吸管和离心管，将步骤五的单个核细胞层尽量吸完注入离心管内，然后加入D
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Hanks溶液或者PBS液，然后进行离心处理；步骤七：在步骤六中得到的离心液，静置分层后，用毛细吸管吸取上清液，之后加入微小核糖核酸溶液，低温4
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6度，静置8
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15min；步骤八：将步骤七得到的细胞悬液，再次进行离心处理，调整离心机转速为1800r/min，离心时间为25m...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐子恩，弗莱德，
申请(专利权)人：范德里希上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：