一种树突状细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种树突状细胞的制备方法，通过常规方法将单个核细胞进行分离并培养DC细胞，加入重组人粒细胞

【技术实现步骤摘要】
一种树突状细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种树突状细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]树突状细胞(Dendritic Cells)也称DC细胞，其存在于外周血、淋巴器官及胸腺中，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名，是功能最强大的抗原递呈细胞，抗原递呈细胞是能摄取、加工处理抗原，并将抗原递呈给淋巴细胞的一类免疫细胞，作为特异性肿瘤杀伤细胞生产和制备过程中不可缺少的组成部分，在肿瘤的免疫治疗中发挥着不可替代的作用；
[0003]目前，常规DC的制备方法是先分离出外周血中的单个核细胞，加入DC无血清培养液中，然后加入适量的重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子，白细胞介素4等细胞因子将单核细胞培养成DC细胞，再加入相应的肿瘤抗原继续培养，使DC成为负载肿瘤抗原的DC，但是，DC的抗原递呈能力与其成熟状态密切相关，常规制备的未成熟DC，抗原摄取和加工能力较强，但是抗原递呈能力较弱，且不能激活T细胞，而是抑制T细胞的增殖，而激活T细胞，引起免疫反应，恰恰是与未成熟DC相反的成熟DC，为此，我们提出了一种树突状细胞的制备方法。

技术实现思路

[0004]鉴于现有技术中所存在的问题，本专利技术公开了一种树突状细胞的制备方法，
[0005]本专利技术，使用到的细胞包括重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子
‑
α、白细胞介素
‑
1β、白细胞介素
‑
6和前列腺素E2
[0006]重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子：GM
‑
CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞集落的形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能，GM
‑
CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，增强细胞的抗原递呈功能，增强DC的存活。
[0007]重组人白细胞介素4：IL
‑
4(白细胞介素
‑
4)在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化，培养过程中若不添加IL
‑
4，单核细胞将分化未巨噬细胞，同时，IL
‑
4与GM
‑
CSF之间的共同作用，可使单核细胞定向分化为未成熟DC，此时，DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但是抗原递呈能力较弱。
[0008]重组人肿瘤坏死因子
‑
α:TNF
‑
α(重组人肿瘤坏死因子
‑
α)是一种在免疫调节和抗肿瘤防御机制中起重要作用的细胞因子，TNF
‑
α可以刺激靶细胞，诱导MHC抗原、可直接杀伤肿瘤细胞，通过TNF
‑
α，IL
‑
1β和IL
‑
6组合可诱导DC完全成熟，使DC的抗原摄取和加工能力减弱，提高抗原递呈能力，可激活T细胞。
[0009]白细胞介素
‑
1β：IL
‑
1β(白细胞介素
‑
1β)是一种炎症免疫反应的启动因子，具有激活各种炎症细胞的作用。
[0010]白细胞介素
‑
6：IL
‑
6(白细胞介素
‑
6)是一种多功能的细胞因子，具有多种生物活
性，可调节免疫应答、刺激细胞生长，促进细胞分化，抑制细胞凋亡，促进炎性反应。
[0011]前列腺素E2：PGE2(前列腺素E2)是炎性介质，可由TNF
‑
α，IL
‑
1β和LPS(脂多糖)等炎症信号诱导产生，在TNF
‑
α，IL
‑
1β和IL
‑
6成熟诱导组合中添加PGE2，可进一步提高DC的产量、成熟度、迁移能力和免疫激活能力，使诱导成熟的DC因表面趋化因子受体的高表达，而引起对抗肿瘤的免疫反应。
[0012]采用的技术方案是，包括以下步骤：步骤一：采集外周血并对单个核细胞进行分离；步骤二：将步骤1中获得的单个核细胞加入DC无血清培养液中，置于培养器皿中，使用温度在37.0℃
‑
37.6℃，4.6％
‑
5.3％的CO2培养箱中培养4.5
‑
5.5h，以使单核细胞贴壁；步骤三：吸弃步骤二中培养皿内的悬浮细胞，使用RPMI
‑
1640培养液洗涤去除步骤二非贴壁细胞，在贴壁细胞中加入含重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子与重组人白细胞介素4的无血清培养液，并使用温度在36.9℃
‑
37.1℃，5％的CO2培养箱中培养7
‑
8天，诱导单核细胞向DC细胞分化，即可收获树突状细胞。
[0013]作为本专利技术的一种树突状细胞的制备方法优选技术方案，所述步骤一使用血细胞分离机对外周血进行分离得到PBMC。
[0014]作为本专利技术的一种树突状细胞的制备方法优选技术方案，所述血细胞分离机的离心速度为：1500r/min
‑
1800r/min，离心时间为：10.5
‑
20.5min。
[0015]作为本专利技术的一种树突状细胞的制备方法优选技术方案，所述步骤二培养器皿为6孔培养板。
[0016]作为本专利技术的一种树突状细胞的制备方法优选技术方案，所述步骤三重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子为：500
‑
1000u/ml，所述重组人白细胞介素4为250
‑
500u/ml。
[0017]作为本专利技术的一种树突状细胞的制备方法优选技术方案，所述步骤三分别在第2天，第4天，第6天对重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子与重组人白细胞介素4的无血清培养液进行半量换液，并加入含重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子与重组人白细胞介素4的RPMI
‑
1640完全培养基。
[0018]作为本专利技术的一种树突状细胞的制备方法优选技术方案，所述RPMI
‑
1640完全培养基内重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子的终浓度为：500
‑
1000u/ml，重组人白细胞介素4浓度为：500
‑
1000u/ml。
[0019]作为本专利技术的一种树突状细胞的制备方法优选技术方案，所述步骤三在培养的第6天，可加入重组人肿瘤坏死因子
‑
α，白细胞介素
‑
1β，白细胞介素
‑
6和前列腺素E2，诱导DC细胞成熟。
[0020]作为本专利技术的一种树突状细胞的制备方法优选技术方案，所述重组人肿瘤坏死因子
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：采集外周血并对单个核细胞进行分离；步骤二：将步骤1中获得的单个核细胞加入DC无血清培养液中，置于培养器皿中，使用温度在37.0℃
‑
37.6℃，4.6％
‑
5.3％的CO2培养箱中培养4.5
‑
5.5h，以使单核细胞贴壁；步骤三：吸弃步骤二中培养皿内的悬浮细胞，使用RPMI
‑
1640培养液洗涤去除步骤二非贴壁细胞，在贴壁细胞中加入含重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子与重组人白细胞介素4的无血清培养液，并使用温度在36.9℃
‑
37.1℃，5％的CO2培养箱中培养7
‑
8天，诱导单核细胞向DC细胞分化，即可收获树突状细胞。2.根据权利要求1所述的一种树突状细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤一使用血细胞分离机对外周血进行分离得到PBMC。3.根据权利要求2所述的一种树突状细胞的制备方法，其特征在于：所述血细胞分离机的离心速度为：1500r/min
‑
1800r/min，离心时间为：10.5
‑
20.5min。4.根据权利要求1所述的一种树突状细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤二培养器皿为6孔培养板。5.根据权利要求1所述的一种树突状细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤三重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子为：500
‑
1000u/ml，所述重组人白细胞介素4为250
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐子恩，弗莱德，
申请(专利权)人：范德里希上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：