一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，并展示了这种方法在脑部疾病研究中的重要应用。该方法的过程包含：正确剥离小鼠脑膜，切碎，利用胶原酶消化并得到脑膜消化液，用percoll密度梯度离心法分离脑膜中单核细胞，细胞表面染色结合细胞核内染色以及流式细胞仪检测固有淋巴细胞以及固有淋巴细胞亚群(ILC1，ILC2，ILC3)的占比情况等过程。本发明专利技术有效地检测到了小鼠脑膜中的固有淋巴细胞，填补了长时间以来人们无法直接获取脑部固有淋巴细胞的空白，为脑膜免疫的研究工作奠定了实验基础。了实验基础。了实验基础。

【技术实现步骤摘要】
一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法及应用


[0001]本专利技术属于细胞分离
，涉及一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法及应用。

技术介绍

[0002]长期以来大脑都被认为受到了血脑屏障的保护因而是一种免疫特权系统，传统的理论认为大脑因为缺乏淋巴引流并且免疫细胞难以到达而不参与免疫反应。直到最近人们才发现脑膜中存在稳定的淋巴管，进一步的实验表明脑膜在指导和协调免疫方面起到重要作用。
[0003]现如今，脑膜免疫已经开始被国内外研究机构广泛应用于各种心脑血管疾病的研究中，并且展示出其在临床上的重大价值。然而，人们对于脑膜免疫的认识还十分欠缺，许多重要的机制还不清楚，实验手段和方法比较匮乏。尤其在对脑膜中的固有淋巴细胞的研究，鲜有相关工作被报导。
[0004]固有淋巴细胞是一种新型的免疫细胞，近几年来一直受到广泛关注。固有淋巴细胞通过分泌细胞因子以及对免疫细胞进行调节来促进免疫。固有淋巴细胞主要驻留于组织，多数存在于淋巴和非淋巴组织中，研究认为，检测不同组织中的固有淋巴细胞对于确定疾病机制，开发治疗疾病新手段具有重要价值。目前的实验表明固有淋巴细胞在调节心脑血管疾病，标志疾病状态上都有潜在应用。随着脑膜免疫的研究不断深入，直接分离脑膜中的固有淋巴细胞对于心脑血管疾病的研究具有重要意义，然而目前仍然缺乏分离小鼠脑膜中固有淋巴细胞的实用方法。
[0005]本专利技术基于小鼠脑膜剥离方法和流式细胞分析技术提供了一种分离小鼠脑膜中固有淋巴细胞的方法，并且将这种方法应用于脑卒中疾病的研究中，分析了脑膜中固有淋巴细胞在小鼠患病和治愈过程中的变化，以此可以将固有淋巴细胞作为脑卒中过程的标志物。该工作为未来更全面的脑膜固有免疫实验奠定了实验基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一个目的是为填补目前脑膜免疫研究中检测固有淋巴细胞技术的空白，提供了一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，该方法可以成熟稳定地检测小鼠脑膜中固有淋巴细胞，为日后的脑膜免疫学实验提供了技术支持，本专利技术还包含剥离可用于后续检测环节的小鼠脑膜和制备可用于流式检测方案的样品两个环节。
[0007]本专利技术的第一个目的可通过下列技术方案来实现：
[0008]一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，该方法包括以下步骤：
[0009]步骤一：打开无菌操作台，麻醉小鼠；
[0010]步骤二：对小鼠进行心脏灌流，剥离小鼠脑膜，收集小鼠脑膜组织；
[0011]步骤三：对获取的组织切碎，消化；
[0012]步骤四：过滤消化液，并将未消化的部分轻微研磨过滤网，离心后去上清；
[0013]步骤五：进行percoll密度梯度离心，并收集沉淀在底部的细胞；
[0014]步骤六：将收集细胞加入CD16/32，避光封闭5min；
[0015]步骤七：将避光封闭后样本进行细胞表面染色，避光孵育30min；
[0016]步骤八：将步骤7处理后的样本加入PBS缓冲液，清洗；
[0017]步骤九：固定细胞表面抗体，破除细胞核膜，清洗，进行细胞核内染色；
[0018]步骤十：利用流式细胞仪分析染色好的单细胞悬液，并检测固有淋巴细胞的含量以及固有淋巴细胞亚群(ILC1，ILC2，ILC3)的占比情况。
[0019]进一步地，所述步骤二中，小鼠麻醉后，要用pH值7.4，0.01M冰冷的PBS经心灌注以去除外周血；
[0020]更进一步地，根据专利技术的具体实施方案，脊髓脱臼法处死小鼠后断头，对小鼠颅骨进行手术操作以剥离小鼠脑膜，并分别收集不同部位的小鼠脑膜。具体剥离小鼠脑膜的流程详见具体实施方式部分。
[0021]进一步地，所述步骤三中使用的胶原酶和溶液是2.0mg/mL胶原酶D和0.1mg/mL DNase I的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)；
[0022]更进一步地，消化条件的设置是：在37℃下的摇臂上低速转动35分钟。
[0023]进一步地，所述步骤四中取上层清夜后将其通过100目过滤器。
[0024]进一步地，所述步骤五中Percoll配方为：3.7ml Percoll原液(GE Healthcare)+1ml 10
×
PBS 5.3ml纯水。(每10ml)
[0025]进一步地，所述步骤六中CD16/32封闭非特异性抗体，在每个样品中加入0.5ul即可达到较好的封闭效果。
[0026]进一步地，所述步骤七中，先加入0.5ul/test死活染料，再进行细胞表面抗体染色1.5ul/test PerCP.Cy5.5
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anti mouse CD45、PE
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Cy7
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anti mouse CD127、PE
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anti mouse
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ST2、5ul/test FITC
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anti mouse Lineage Cocktail。
[0027]进一步地，所述步骤八中，为了清除多余的染料每管加入1mlPBS的缓冲液，离心条件为4℃，350g
×
5min。
[0028]进一步地，所述步骤九中，加入的固定破膜液为1ml/test，在4℃冰箱避光孵育40
‑
50min；
[0029]更进一步地，在上述步骤完成后，使用1ml 1
×
洗液930g清洗5min共两遍。
[0030]进一步地，在所述步骤十中，使用型号为BD canto II流式分析仪进行流式细胞分析；将流式细胞仪设置为CD45+Lineage
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CD127+，检测固有淋巴细胞；将流式细胞仪设置为CD45+Lineage
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CD127+Tbet+，检测ILC1细胞；将流式细胞仪设置为CD45+Lineage
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CD127+ST2+，检测ILC2细胞；将流式细胞仪设置为CD45+Lineage
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CD127+RORγt+细胞，检测ILC3细胞。
[0031]本专利技术的第二个目的是利用上述方法展示在脑部疾病研究中的重要应用。
[0032]本专利技术的第二个目的可通过下列技术方案来实现：
[0033]一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的应用，该应用能利用上述方法分别检测假手术和大脑中动脉阻塞(MCAO)小鼠脑膜中固有淋巴细胞含量，以及固有淋巴细胞亚群的失衡情况，以此来分析脑膜免疫在临床中的应用。
[0034]进一步地，在该应用中，我们取两组小鼠进行脑膜中固有淋巴细胞及其亚群的检
测，一组小鼠是假手术组，另一组小鼠利用手术使其患有大脑中动脉阻塞(MCAO)疾病。
[0035]检测结果表明，MCAO小鼠脑膜内的固有淋巴细胞有所增加，出现明显固有淋巴细胞亚群失衡的情况，ILC1细胞含量显著增加，ILC3细胞含量有所增加。
[0036]该结果还表明，固有淋巴细胞亚群失衡可作为心脑血管本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：正确剥离小鼠脑膜，收集小鼠脑膜组织；对获取组织切碎，消化并进行过滤，离心，取沉淀部分；用percoll密度梯度离心法分离脑膜中的单核细胞；将收集到的单核细胞表面非特异性抗体封闭；将封闭后样本进行死活染色和细胞表面染色，避光孵育；加入缓冲液，清洗；固定破除细胞核膜后，清洗，再进行细胞核内转录因子染色；利用流式分析仪分析染色好的细胞悬液样本，并检测样本中固有淋巴细胞的含量以及固有淋巴细胞亚群(ILC1，ILC2，ILC3)的占比情况。2.根据权利要求1所述的一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述的收集脑膜的步骤如下：首先使用pH值7.4，0.01M PBS彻底经心灌注，利用脊髓脱臼法处死小鼠；进行断头操作，剪开头皮，暴露出完整颅骨，经过手术处理，收集小鼠的整个颅骨；将脑膜从脑表面和颅骨内部沿外侧至内侧方向剥离；将大脑分为小脑、脑干和大脑，从脑室、脑干和小脑皱襞中分别收集脑膜。3.根据权利要求1所述的一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述的消化操作的步骤如下：每只小鼠的脑膜加入3～5ml浓度为2～2.5(mg/ml)的胶原酶D以及0.1mg/ml的DNase1消化，加入胶原酶D后在37℃间的恒温箱中的摇臂上缓慢转动消化30～35分钟。4.根据权利要求3所述的一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述脑膜组织的消化溶液是用100目的筛网过滤。5.根据权利要求1所述的一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述Percoll法分离得到脑膜淋巴细胞的操作：用35％
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【专利技术属性】
技术研发人员：李庆，蒋子然，
申请(专利权)人：安徽省立医院中国科学技术大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：