一种外周血单个核细胞分离方法技术

本发明专利技术公开了一种外周血单个核细胞分离方法，涉及细胞分离技术领域。本发明专利技术提供分离方法，采用分离装置对外周血单个核细胞进行分离，通过取样单元将采血袋内的外周血样品经过连接件转移到静置袋中。进一步地，通过加样单元将羟乙基淀粉，经过连接件添加到静置袋中，使羟乙基淀粉与血液混匀。之后密封静置袋与连接件之间的管路，将静置袋倒挂静置，使转移袋位于静置袋的上侧。待静置袋内的上清液与沉淀分层时，通过缓慢挤压静置袋将上清液转移到转移袋中，从而实现对上清液中的外周血单个核细胞的快速分离。利用本发明专利技术提供的外周血单个核细胞分离方法进行外周血单个核细胞分离，具有分离效率高，对细胞损伤小，WBC回收率高的优点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种外周血单个核细胞分离方法


[0001]本专利技术涉及细胞分离
，尤其涉及一种外周血单个核细胞分离方法。

技术介绍

[0002]外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验最常用的细胞，具有较强的体外培养扩增潜能。目前，单个核细胞治疗已在国内外得到大范围的研究与推广，疾病通过体外培养、增殖、激活，回输体内即可诱导自体抗病毒免疫应答，人体抗病毒免疫一旦被激活就会源源不断产生抗病毒的物质杀灭病毒。有杀伤肿瘤细胞作用的T细胞经激活后在体内大多数变为记忆细胞储存在淋巴组织内，为彻底清除肿瘤细胞和防治转移复发提供了长期保护。随着年龄增长，体内外周血单个核细胞活性也随之降低，所以在年轻的时期冻存具有较高活力的单个核细胞，对于未来免疫治疗有着重要意义。
[0003]目前外周血单个核细胞分离，主要采用ficoll方法，目前该方法存在以下不足：
[0004]1、操作相对复杂，需精准控制铺层速度，对操作人员熟练度要求较高，另外样本手工开放式操作时间长，引入外源性污染风险高；
[0005]2、需要多次离心操作，高速离心对细胞容易造成损伤，使分离得到细胞活率较低；
[0006]3、单个核细胞回收率较低且操作时间长，不适用于批量外周血的分离操作。
[0007]针对上述ficoll方法分离外周血单个核细胞存在的一系列不足，因此急需一种全新分离方法，解决目前外周血单个核分离操作复杂、操作时间长、易对细胞造成损伤、细胞回收率低、引入外源性污染风险高等技术难题。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题是目前的外周血单个核细胞分离方法存在操作复杂、操作时间长、易对细胞造成损伤、细胞回收率低、引入外源性污染风险高。
[0009]为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：
[0010]一种外周血单个核细胞分离方法，采用分离装置对外周血单个核细胞进行分离，所述分离装置，包括取样单元、加样单元、连接件、静置袋以及转移袋；所述取样单元、加样单元以及所述静置袋均与所述连接件连接，所述连接件将所述静置袋与所述取样单元以及所述加样单元连通；所述静置袋与所述转移袋之间用管道连通；所述转移袋连接有末端封闭的管道；
[0011]所述分离方法包括以下步骤：
[0012]S1、使用消毒酒精对采血袋表面进行消毒，传入正常开启的生物安全柜内，并轻揉采血袋，使袋内血液充分混匀；
[0013]S2、利用取样单元对采血袋内的血液进行取样，使血液经连接件由采血袋转移至静置袋内；
[0014]S3、向加样单元中加入羟乙基淀粉，使羟乙基淀粉经连接件转移至静置袋内，与血
液充分混匀；
[0015]S4、封闭连接件与静置袋之间的连通管路，将静置袋倒挂，进行血液静置分离；
[0016]S5、待静置袋内的上清与沉淀比例达到1:1时，将上清液由静置袋转移至转移袋内；
[0017]S6、使用消毒酒精对转移袋连接的末端封闭管道进行消毒，用无菌剪刀剪开管道，将转移袋内的上清液转移至离心管内；
[0018]S7、将装有上清液的离心管，使用移液管取样计算细胞数量及活率；
[0019]S8、在室温下，以参数为200
‑
500g、3
‑
10min对S7的离心管进行离心；
[0020]S9、去除离心上清，根据S7的计数结果，按预设冻存密度加入提前4℃预冷的冻存液，混匀分装至冻存管内，得到装有单个核细胞的冻存管；
[0021]S10、将分装于冻存管的单个核细胞进行程序降温，降温结束后转移至
‑
150℃以下的液氮罐储存。
[0022]需要说明的是，所述消毒酒精为医用消毒酒精，浓度为75％(体积分数)。
[0023]在一个或多个实施方案中，本专利技术的步骤S8，离心参数可以是200g、300g、400g、或500g；离心时间可以是3min、4min、5min、7min、9min，或10min。
[0024]其进一步的技术方案为，所述步骤S1和S2之间还包括：使用一次性注射器从采血袋的开口端穿刺取样，用于全血细胞计数。需要说明的是，对于步骤S7以及上述取样计数的操作，一般取0.5ml血样进行细胞数量计数。
[0025]其进一步的技术方案为，所述步骤S1之前还包括对采血袋称重，获取血液的重量，通过单位换算将血液的重量单位换算为体积单位。
[0026]在实际操作中，按1.03的比例将血液对重量单位转化为体积单位；例如，外周血的重量记为g(克)，其体积V＝g/1.03(毫升)。
[0027]其进一步的技术方案为，所述步骤S3中，按羟乙基淀粉的体积与血液的体积比为1:3～1:5的比例进行添加。
[0028]其进一步的技术方案为，所述步骤S9中，预设的冻存密度为1*107～4*107个/ml。
[0029]其进一步的技术方案为，所述步骤S9中，所述冻存液由基础免疫培养基、DMSO和人血红蛋白按18:1:1的体积比混合配制而成。
[0030]其进一步的技术方案为，所述步骤S5中，使用分浆夹将上清由静置袋转移至转移袋内。
[0031]其进一步的技术方案为，所述连接件为三通管，所述三通管包括三个接口，所述三通管的三个接口分别与所述取样单元、所述加样单元以及所述静置袋连接。
[0032]其进一步的技术方案为，所述取样单元包括穿刺器，将所述取样单元与所述连接件之间的连通管道记为第一液体输送管，所述第一液体输送管的两端分别与所述穿刺器以及所述三通管的接口连接。
[0033]具体实施中，步骤S2中，用取样单元的穿刺器进行取样，血液由穿刺器经第一液体输送管、连接件，由采血袋转移至静置袋内。
[0034]其进一步的技术方案为，所述取样单元与连接件之间的连通管道上设有第一开关，用于控制取样单元与连接件之间的管路连通状态。即所述第一液体输送管上设有第一开关，用于控制第一液体输送管的连通状态。
[0035]其进一步的技术方案为，所述穿刺器的末端为形状类似三角形的尖端。
[0036]其进一步的技术方案为，将所述加样单元与所述连接件之间的连通管道记为第二液体输送管，所述加样单元包括胶塞，所述胶塞密封设于所述第二液体输送管的一端，所述第二液体输送管的另一端与所述三通管的接口连通。
[0037]其进一步的技术方案为，所述步骤S4中封闭连接件与静置袋之间的连通管路，具体是指热合密封的方式来封闭连接件与静置袋之间的连通管路。
[0038]更具体的实施方案中，热合密封连接件与静置袋之间管路，然后将靠近连接件端的管路切断。
[0039]具体实施中，将所述连接件与静置袋之间的连通管道记为第三液体输送管，所述第三液体输送管的两端分别与所述静置袋以及所述三通管的接口连通。所述步骤S4中封闭连接件与静置袋之间的连通管路，具体是指热合密封第三液体输送管，更进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，采用分离装置对外周血单个核细胞进行分离，所述分离装置，包括取样单元、加样单元、连接件、静置袋以及转移袋；所述取样单元、加样单元以及所述静置袋均与所述连接件连接，所述连接件将所述静置袋与所述取样单元以及所述加样单元连通；所述静置袋与所述转移袋之间用管道连通；所述转移袋连接有末端封闭的管道；所述分离方法包括以下步骤：S1、使用消毒酒精对采血袋表面进行消毒，传入正常开启的生物安全柜内，并轻揉采血袋，使袋内血液充分混匀；S2、利用取样单元对采血袋内的血液进行取样，使血液经连接件由采血袋转移至静置袋内；S3、向加样单元中加入羟乙基淀粉，使羟乙基淀粉经连接件转移至静置袋内，与血液充分混匀；S4、封闭连接件与静置袋之间的连通管路，将静置袋倒挂，进行血液静置分离；S5、待静置袋内的上清与沉淀比例达到1:1时，将上清液由静置袋转移至转移袋内；S6、使用消毒酒精对转移袋连接的末端封闭管道进行消毒，用无菌剪刀剪开管道，将转移袋内的上清液转移至离心管内；S7、将装有上清液的离心管，使用移液管取样计算细胞数量及活率；S8、在室温下，以参数为200
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500g、3
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10min对S7的离心管进行离心；S9、去除离心上清，根据S7的计数结果，按预设冻存密度加入提前4℃预冷的冻存液，混匀分装至冻存管内，得到装有单个核细胞的冻存管；S10、将分装于冻存管的单个核细胞进行程序降温，降温结束后转移至
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150℃以下的液氮罐储存。2.如权利要求1所述的外周血单个核细...

【专利技术属性】
技术研发人员：李政，钟桂强，韦棋，王清芳，陈辉，张芬，钟振忠，梁晓，
申请(专利权)人：深圳市北科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：