一种NK细胞的扩增方法技术

本发明专利技术涉及一种NK细胞的扩增方法。本发明专利技术使用的CD16、曲妥珠单抗可以快速有效的使NK细胞受到信号刺激，并利用抗癌药Krestin作为细胞刺激因子，活化NK细胞，促进细胞因子的合成，有效提高NK细胞的杀伤毒性，在培养液中提供了NK细胞生长所需的多个激活及扩增信号蛋白分子，提高不同来源单个核细胞中NK细胞的扩增效率；培养过程中先在包被的培养瓶中培养，再用细胞培养袋培养，既可以保证NK细胞被充分激活，又避免了高浓度抗体对细胞诱发的凋亡，保证了扩增效率。整个培养过程易控，利用本方法可在体外大规模扩增数量多、细胞活性高、杀伤力强的NK细胞，选用的药剂易得，可有效降低细胞培养成本。胞培养成本。

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞的扩增方法


[0001]本专利技术涉及细胞工程
，具体为一种NK细胞的扩增方法。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，其细胞形态也与T、B细胞不同，NK细胞是胞浆中含嗜天青颗粒的大颗粒淋巴细胞，广泛存在于淋巴器官和外周组织中，在正常外周血中约占淋巴细胞总数的5％
‑
10％，脾中占1％
‑
2％，淋巴结和骨髓中也有NK细胞存在。NK细胞作为人体天然免疫的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞，在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用。
[0003]随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解，利用NK细胞为靶点的免疫治疗对疾病的早期预防、控制和治疗具有重要意义。长期以来的研究表明在某些疾病的发生过程中，如肿瘤、自身免疫性疾病、衰老相关性疾病和HIV感染等，会导致NK细胞比例、数量和功能降低。目前，NK细胞扩增的主要方法为用细胞因子长期培养和使用不同来源的同种异体饲养细胞。尽管有不错的扩增效果，但这些方案达不到许多国家的临床使用标准，要么是因为培养未使用临床级材料，要么是因为使用同种异体饲养细胞可能会导致其他疾病的传播，以及带来医学伦理问题。

技术实现思路

[0004]鉴于现有技术中所存在的问题，本专利技术公开了一种NK细胞的扩增方法，包括步骤如下：步骤一、抽取外周血并加入肝素钠抗凝，通过血细胞分离机从外周血中分离出含NK细胞的单个核细胞，分离的血浆收集待用；步骤二、使用包被液对用于培养NK细胞的细胞培养瓶进行包被处理，处理不小于24小时后，取出包被液；步骤三、在细胞激活培养液中添加细胞刺激因子进行单个核细胞激活；步骤四、在步骤二中包被处理后的细胞培养瓶中放入诱导培养液，将激活后的单个核细胞接种到细胞培养瓶中；步骤五、使用诱导培养液对单个核细胞进行诱导培养，培养过程中没间隔1
‑
2天补充培养液一次，维持细胞密度在8.0
×
105/mL
‑
2.0
×
106/mL；步骤六、在细胞培养瓶中培养10天后，转入细胞培养袋中培养，培养过程中没间隔2
‑
3天补充培养液一次，维持细胞密度在1.0
×
106/mL
‑
2.0
×
106/mL，培养14
‑
18天获得NK细胞。
[0005]作为本专利技术的一种优选方案，步骤一中所述外周血与肝素钠的体积比为45
‑
55:1。
[0006]作为本专利技术的一种优选方案，步骤二中所述包被液为CD16单抗30
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34μg、曲妥珠单抗3
‑
4mg。
[0007]作为本专利技术的一种优选方案，步骤三中所述细胞刺激因子为抗癌药Krestin。
[0008]作为本专利技术的一种优选方案，步骤四中所述诱导培养液主要成分为：在GT
‑
T551H3培养液的基础上，添加500IU/mL的重组人白介素
‑
2、500IU/mL重组人白介素
‑
15、300IU/mL重组人白介素
‑
21、300IU/mL重组人干细胞生长因子、300IU/mL三磷酸腺苷二钠注射液、300IU/mL注射用辅酶A、10％的步骤一中分离出的血浆。
[0009]本专利技术的有益效果：本专利技术使用的CD16、曲妥珠单抗可以快速有效的使NK细胞受到信号刺激，并利用抗癌药Krestin作为细胞刺激因子，活化NK细胞，促进细胞因子的合成，有效提高NK细胞的杀伤毒性，在培养液中提供了NK细胞生长所需的多个激活及扩增信号蛋白分子，提高不同来源单个核细胞中NK细胞的扩增效率；培养过程中先在包被的培养瓶中培养，再用细胞培养袋培养，既可以保证NK细胞被充分激活，又避免了高浓度抗体对细胞诱发的凋亡，保证了扩增效率。整个培养过程易控，利用本方法可在体外大规模扩增数量多、细胞活性高、杀伤力强的NK细胞，选用的药剂易得，可有效降低细胞培养成本。
具体实施方式
[0010]实施例1
[0011]本专利技术的一种NK细胞的扩增方法，包括步骤如下：步骤一、抽取外周血并加入肝素钠抗凝，所述外周血与肝素钠的体积比为45:1，通过血细胞分离机从外周血中分离出含NK细胞的单个核细胞，分离的血浆收集待用；步骤二、使用包被液对用于培养NK细胞的细胞培养瓶进行包被处理，所述包被液为CD16单抗30μg、曲妥珠单抗3mg，处理不小于24小时后，取出包被液；步骤三、在细胞激活培养液中添加细胞刺激因子进行单个核细胞激活，所述细胞刺激因子为抗癌药Krestin；步骤四、在步骤二中包被处理后的细胞培养瓶中放入诱导培养液，将激活后的单个核细胞接种到细胞培养瓶中，所述诱导培养液主要成分为：在GT
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T551H3培养液的基础上，添加500IU/mL的重组人白介素
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2、500IU/mL重组人白介素
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15、300IU/mL重组人白介素
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21、300IU/mL重组人干细胞生长因子、300IU/mL三磷酸腺苷二钠注射液、300IU/mL注射用辅酶A、10％的步骤一中分离出的血浆；步骤五、使用诱导培养液对单个核细胞进行诱导培养，培养过程中没间隔1天补充培养液一次，维持细胞密度在8.0
×
105/mL；步骤六、在细胞培养瓶中培养10天后，转入细胞培养袋中培养，培养过程中没间隔2天补充培养液一次，维持细胞密度在1.0
×
106/mL，培养14天获得NK细胞。
[0012]实施例2
[0013]本专利技术的一种NK细胞的扩增方法，包括步骤如下：步骤一、抽取外周血并加入肝素钠抗凝，所述外周血与肝素钠的体积比为55:1，通过血细胞分离机从外周血中分离出含NK细胞的单个核细胞，分离的血浆收集待用；步骤二、使用包被液对用于培养NK细胞的细胞培养瓶进行包被处理，所述包被液为CD16单抗34μg、曲妥珠单抗4mg，处理不小于24小时后，取出包被液；步骤三、在细胞激活培养液中添加细胞刺激因子进行单个核细胞激活，所述细胞刺激因子为抗癌药Krestin；
步骤四、在步骤二中包被处理后的细胞培养瓶中放入诱导培养液，将激活后的单个核细胞接种到细胞培养瓶中，所述诱导培养液主要成分为：在GT
‑
T551H3培养液的基础上，添加500IU/mL的重组人白介素
‑
2、500IU/mL重组人白介素
‑
15、300IU/mL重组人白介素
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21、300IU/mL重组人干细胞生长因子、300IU/mL三磷酸腺苷二钠注射液、300IU/mL注射用辅酶A、10％的步骤一中分离出的血浆；步骤五、使用诱导培养液对单个核细胞进行诱导培养，培养过程中没间隔2天补充培养液一次，维持细胞密度在2.0
×
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞的扩增方法，其特征在于，包括步骤如下：步骤一、抽取外周血并加入肝素钠抗凝，通过血细胞分离机从外周血中分离出含NK细胞的单个核细胞，分离的血浆收集待用；步骤二、使用包被液对用于培养NK细胞的细胞培养瓶进行包被处理，处理不小于24小时后，取出包被液；步骤三、在细胞激活培养液中添加细胞刺激因子进行单个核细胞激活；步骤四、在步骤二中包被处理后的细胞培养瓶中放入诱导培养液，将激活后的单个核细胞接种到细胞培养瓶中；步骤五、使用诱导培养液对单个核细胞进行诱导培养，培养过程中没间隔1
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2天补充培养液一次，维持细胞密度在8.0
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105/mL
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2.0
×
106/mL；步骤六、在细胞培养瓶中培养10天后，转入细胞培养袋中培养，培养过程中没间隔2
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3天补充培养液一次，维持细胞密度在1.0
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106/mL
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2.0
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106/mL，培养14
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐子恩，弗莱德，
申请(专利权)人：贝美缇上海健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：