一种用于提高多发性骨髓瘤患者的DC细胞活性的培养基及其培养方法技术

本发明专利技术公开了一种用于提高多发性骨髓瘤患者的DC细胞活性的培养基及其培养方法，属于生物医药技术领域，所述培养基包括RPMI 1640培养基，还包括益母草碱；本方法在DC细胞体外培养时，加入适量益母草碱表现出显著的提升健康人及多发性骨髓瘤患者DC细胞活性及成熟度的作用，显示出作为DC佐剂的潜力，可用于基于DC的治疗策略，例如DC疫苗和DC细胞疗法等。例如DC疫苗和DC细胞疗法等。例如DC疫苗和DC细胞疗法等。

【技术实现步骤摘要】
一种用于提高多发性骨髓瘤患者的DC细胞活性的培养基及其培养方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种提高多发性骨髓瘤患者的DC细胞活性的细胞培养基及培养方法。

技术介绍

[0002]多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)为浆细胞来源的恶性肿瘤，目前发病率高居血液系统恶性肿瘤第二位，至今仍不可治愈，患者终将面对疾病复发。MM发病与染色体的缺失、基因异常表达、免疫微环境改变等密切相关，且在疾病早期就已经出现免疫紊乱。由此，以提升患者自体抗骨髓瘤免疫力的免疫治疗策略，可以通过提升机体免疫监视、免疫活化、免疫杀伤效应，而有效清除体内癌细胞，甚至达到彻底治愈的目的。
[0003]而树突状细胞(Dendritic cell,DC)在启动机体抗肿瘤免疫应答中起着关键作用，DC细胞作为最重要的抗原递呈细胞，通过递呈MHC分子以及肿瘤抗原给初始T细胞识别、同时提供T细胞活化所需的共刺激信号，并促进Th细胞以及细胞毒性T淋巴细胞的分化增殖，从而为启动机体特异性抗肿瘤免疫应答最为关键的第一步。
[0004]研究显示，MM患者表现为显著的免疫缺陷，其中患者体内严重免疫缺陷的DC细胞为特异性抗肿瘤免疫力不能被正常、有效激活的主要原因之一，导致疾病的发生发展。由此，逆转患者体内DC细胞的严重免疫缺陷状态，恢复或提升患者DC细胞活性及成熟度，为亟待解决的关键问题之一。
[0005]因此，体外培养、诱导形成MM患者自体来源的DC细胞并显著增强其活性及成熟度，之后将其DC细胞回输至患者体内的免疫治疗策略为近年来国内外研究的前沿热点方向，具有良好的研究及转化应用前景。
[0006]现有的常规体外培养、诱导形成DC细胞的方法一般为：从外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)，将PBMCs在1640培养基、5vol％人血清、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素组成的培养基中，于37℃、5vol％CO2环境中培养24小时，以使其中DC前体细胞(单核细胞)黏附、贴壁。其后洗去、弃去未黏附贴壁的细胞，将DC前体细胞在1640培养基、5vol％人血清、800U/mL GM
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CSF、500U/mL IL
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4、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素组成的培养基中，于37℃、5vol％CO2环境中培养7天，以诱导形成DC细胞，其后收获DC细胞。
[0007]当前体外培养诱导形成MM患者自体来源DC并将其回输患者体内的免疫治疗策略已得到一定发展，但现有的常规DC体外诱导培养方法虽然可在一定程度上提升患者DC活性以及成熟度，但距离临床疗效所需的高度活化及成熟的DC刺激出机体显著的抗肿瘤免疫效应、达到显著的临床疗效仍有差距。由此，如何技术创新，研发DC活性和成熟度显著提升的体外DC培养技术，让MM患者免疫缺陷的DC活性及成熟度恢复正常或显著提高，为当前DC治疗策略中亟需解决的关键问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的之一，就在于提供一种提高DC细胞活性的细胞培养基，以解决上述问题。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种提高DC细胞活性的细胞培养基，包括RPMI 1640培养基，还包括益母草碱。
[0010]益母草碱(Leonurine)是我国传统中药材益母草中所含的特异生物碱，为益母草中主要的有效单体成分，有望成为源于中国的少数几个成功的原创药物之一。益母草碱已被报道可通过甲基乙二醛(MGO)调节糖代谢从而展示出治疗糖尿病的可能潜力。同时，专利技术人课题组前期研究已证实，在小鼠及恒河猴的哺乳动物实验模型中，益母草碱显著地改善了血浆中脂质谱，明显地降低了血浆中胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白水平。亦已有研究报道益母草碱可调节脂代谢从而改善动脉粥样硬化。专利技术人课题组前期已研究报道益母草碱给药3周可显著地降低db/db小鼠模型中的空腹血糖水平以及升高血浆中的胰岛素水平，同时降低了血浆甘油三酯浓度以及升高了高密度脂蛋白浓度。
[0011]综上，益母草碱的作用机制与调控糖、脂代谢密切相关，但目前益母草碱对人DC的免疫调节作用及机制仍未见报道。
[0012]本申请研究显示益母草碱能显著提高体外培养、诱导形成DC细胞MHC分子(HLA
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DR)、共刺激分子(CD80\CD86\CD40)、成熟相关标志分子(CD83)的表达，显著提升DC的活性及成熟度。由此，专利技术人开创性地将益母草碱应用到体外培养诱导形成DC细胞的DC培养技术中，以获得高度活化及成熟的DC为具有良好潜力及转化应用前景的技术创新，而将益母草碱应用到DC培养技术中的DC培养技术方案，将于下述部分详细阐述。
[0013]作为优选的技术方案：所述益母草碱的浓度为0.9
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1.1μM。专利技术人经过大量试验证实，益母草碱的浓度在1.1μM以上时，毒性很强，DC细胞活性不好不能达到很好效果；而益母草碱的浓度过低，对DC细胞活性提升不好，目标功效不好，达不到效果；益母草碱不同浓度下DC活性/成熟相关分子表达水平如图10所示。
[0014]根据专利技术人的试验证明：益母草碱的浓度为1μM时，为更优浓度。
[0015]作为进一步优选的技术方案：所述培养基还包括人血清、GM
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CSF、IL
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4、青霉素和链霉素。
[0016]作为更进一步优选的技术方案：所述组分的浓度为：5vol％人血清、800U/mL GM
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CSF、500U/mL IL
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4、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素。
[0017]本专利技术的目的之二，在于提供一种用于提高DC细胞活性的细胞培养方法，采用的技术方案为：在培养基中加入益母草碱。
[0018]作为优选的技术方案，包括下述步骤：
[0019]从外周血中分离出外周血单个核细胞，即PBMCs，将所述PBMCs在1640培养基中，于37℃、5vol％CO2环境中培养24小时，然后洗去、弃去未黏附贴壁的细胞，得到DC前体细胞，然后将所述DC前体细胞于1640培养基、5vol％人血清、800U/mL GM
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CSF、500U/mL IL
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4、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和1μM益母草碱组成的培养基中，于37℃、5vol％CO2培养7天，以诱导形成DC细胞，最后收获得到DC细胞。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本方法发现在体外益母草碱在适当浓度下表现出显著的提升健康人及多发性骨髓瘤患者DC活性及成熟度的作用，显示出益母草碱作
为DC佐剂的潜力，可用于基于DC的治疗策略，例如DC疫苗和DC细胞疗法。
附图说明
[0021]图1为CD80
+
CD86
+
细胞(DCs)在总收获细胞中占比在HD组和MM患者组之间的比较；
[0022]图2为健康人益母草碱组和对照本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提高多发性骨髓瘤患者的DC细胞活性的细胞培养基，包括1640培养基，其特征在于：还包括益母草碱。2.根据权利要求1所述的用于提高多发性骨髓瘤患者的DC细胞活性的细胞培养基，其特征在于：所述益母草碱的浓度为0.9
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1.1μM。3.根据权利要求1所述的用于提高多发性骨髓瘤患者的DC细胞活性的细胞培养基，其特征在于：所述培养基还包括人血清、GM
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CSF、IL
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4、青霉素和链霉素。4.根据权利要求3所述的提高多发性骨髓瘤患者的DC细胞活性的细胞培养基，其特征在于：所述组分的浓度为：5vol％人血清、800U/mL GM
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CSF、500U/mL IL
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4、100U/mL青霉素、0.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：代景莹，何林，陈成，叶子琛，
申请(专利权)人：四川省医学科学院，
类型：发明
国别省市：