一种大规模制备GMP级别的成熟DC细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种大规模制备GMP级别的成熟DC细胞的方法。该方法通过单抗CD14磁珠正向分选法分选得到CD14+细胞，添加rh GM

【技术实现步骤摘要】
一种大规模制备GMP级别的成熟DC细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种大规模制备GMP级别的成熟DC细胞的方法。

技术介绍

[0002]DC细胞是在血液、组织和淋巴器官中发现的一类因长条形树枝状或伸出突触而得名的树突状细胞，是目前已知的功能最强的专职抗原递呈细胞，也是人体内唯一能活化初始T细胞的抗原递呈细胞，其抗原递呈能力远强于巨噬细胞和B细胞。DC细胞在激活T细胞介导的肿瘤免疫细胞治疗中负责启动和调控，其细胞数量仅仅占据外周血中存在的单核细胞的0.1％～0.5％，严重不足，一般采用CD34+造血干细胞和单核细胞分化而来。骨髓或脐带血的CD34+造血干细胞采集困难，容易污染且患者比较痛苦；外周血取材方便，制备较简单，DC细胞获得率高。因此，DC细胞大多数是由外周血来源的单核细胞分化诱导，CD14+已被用作单核细胞的起源。人体临床试验中最常用的研究类型是使用离体产生的单核细胞，即CD14+细胞来源的DC细胞。
[0003]DC细胞的抗肿瘤能力很大程度上取决于其成熟状态。从单核细胞到成熟DC会经过未成熟DC状态，不同分化阶段的DC细胞功能不同，未成熟DC细胞具有很强的摄取、处理和加工抗原能力，成熟DC细胞摄取和加工抗原的能力减弱，而抗原递呈能力逐渐增强。TLR是依赖配体的检测模块，在促进先天和适应性免疫方面起关键作用，也被视为“免疫系统的守门人”。人类中存在10种不同的TLR(TLR1
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10)，单核细胞衍生的DC表达TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9，TLR诱导的DC强力激活，利用它们来获得最佳抗原递呈和T细胞活化。IFN
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γ在DC的成熟诱导中经常用到，IFN
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γ可增强IL
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12p70的产生，是DC成熟的有效刺激物，可上调CD83、CD86等的表达。与未成熟状态相比，成熟DC的形态呈树枝状，有毛刺状突起，形成有大的克隆聚集团，表型典型成熟，高表达一些共刺激分子，并分泌一些共刺激因子和趋化因子。递呈抗原途径有内源途径和外源途径，有的还具有交叉递呈能力。DC细胞负责将MHC
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多肽复合物递呈至T细胞表面被TCR所识别，一个DC细胞可激活100～3000个T细胞。DC可以通过两个途径来处理抗原交叉呈递：胞质途径和液泡途径。在胞质途径中抗原被转移到细胞质中在蛋白酶体上加工后再装载到新形成的MHC I类分子；液泡途径的定义较不明确，但认为发生在胞吞区室中，因为该途径是对蛋白酶体抑制剂有抗药性，但对溶酶体蛋白水解抑制剂敏感，并依赖组织蛋白酶S。目前，DC有多种负载肿瘤抗原形式，如DNA、mRNA、多肽、肿瘤裂解物等。
[0004]树突状细胞是增强抗肿瘤免疫反应的有力工具，也是免疫应答的核心与基础。DC疫苗被证明能安全有效地诱导肿瘤特异性免疫反应，并且患者通常耐受性良好，主要有负载肿瘤相关抗原(TAA)的DC疫苗和个性化多肽疫苗，如PEP
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DC疫苗、PPV
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DC疫苗。
[0005]临床上联合放射治疗或免疫检查点分子，如CTLA
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4和PD
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1，在黑色素瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌等方面取得显著疗效。个性化多肽疫苗的首次人体临床试验已显示靶向单个肿瘤突变特征的可行性、安全性和免疫治疗活性。近日，贝达药业启动2019
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nCoV新型冠
状病毒通用DC疫苗研发及临床研究，将抗原的非侵染性的特定基因转入DC细胞内，针对不同HLA类型，制备通用型DC，成为“现货”DC产品供应。肿瘤免疫治疗主要集中在CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的抗肿瘤活性，CTL可以直接杀死所有肿瘤细胞类型，DC
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CTL通过T细胞受体(TCR)识别主要组织相容物在癌细胞表面呈现的特异性抗原肽消除恶性肿瘤I/β
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微球蛋白复合物，释放穿孔素和颗粒酶B，杀伤靶细胞。最新一代测序技术和新型生物信息学工具预测的肿瘤新生抗原，产生于肿瘤的体细胞突变，利用DC细胞来激活患者自身(自体)肿瘤特异性T细胞，来治疗各种实体瘤，如黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤等，显示出特异性高、免疫原性强、毒副作用小等诱人前景。
[0006]目前，GMP级别的DC细胞的制备方法存在以下问题：(1)大多数原材料来源骨髓造血干细胞，取材有限，制备复杂；(2)DC前体细胞即单核细胞，采用贴壁法分选，得率低，杂质多，限制单个核细胞转化为未成熟DC的产率；(3)DC细胞培养周期长，均不低于7天，其中部分制备方法还需半量换液，工艺复杂；(4)诱导成熟因子种类过多或含有毒副作用的LPS；(5)制备数量较少，最多是在108级，未达到109级以上；(6)DC细胞诱导得率低，一般诱导的DC占PBMC的10％左右；(7)诱导的DC表型差或难以稳定控制，影响其发挥抗原递呈作用；(8)使用融合肽或肿瘤相关抗原，肿瘤裂解物，特异性免疫原性不强；同时基本采用的抗原混合的负载形式，不能消除多肽之间的竞争；(9)部分DC细胞制备过程使用胎牛血清或非GMP级别DC培养基，临床使用受限；(10)制备的DC大多数是一次制备一次回输，即使冻存，复苏后活率低，稳定性差。总之，目前的制备方法制备的DC细胞得率不高，纯度差，表面标记分子表达低，诱导活化T细胞能力弱，影响DC细胞发挥抗原递呈作用；多肽特异性低，影响DC细胞的免疫原性刺激能力；而且，DC细胞冻存后复苏活率低，表型改变，稳定性难以控制；同时制备过程中所有原辅料的供应非药品级或GMP级，不能直接应用临床等。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的为制备GMP级别的成熟DC细胞。
[0008]本专利技术首先保护一种制备GMP级别的成熟DC细胞的方法，依次可包括如下步骤：
[0009](1)从单核细胞中分选CD14+细胞；
[0010](2)向上述CD14+细胞中加入含1
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6％(如1
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4％、4
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6％、1％、2％、3％、4％、5％或6％)HSA的DC细胞培养基，添加rh GM
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CSF和rh IL
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4至在体系中的浓度分别为10
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120ng/ml(如10
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50ng/ml、50
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120ng/ml、10ng/ml、50ng/ml或120ng/ml)和10
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120ng/ml(如10
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100ng/ml、100
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120ng/ml、10ng/ml、100ng/ml或120ng/ml)，培养3
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4天(如3天或4天)；
[0011](3)向步骤(2)体系中加入rhIFN
‑
γ、POLYI:C、rh TNF
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α和rh IL
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1β，得到诱导体系，培养1天；
[0012](4)向步骤(3)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备GMP级别的成熟DC细胞的方法，依次包括如下步骤：(1)从单核细胞中分选CD14+细胞；(2)向所述CD14+细胞中加入含1～6％HSA的DC细胞培养基，添加rh GM
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CSF和rh IL
‑
4至在体系中的浓度分别为10～120ng/ml和10～120ng/ml，培养3
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4天；(3)向步骤(2)所述体系中加入rhIFN
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γ、POLYI:C、rh TNF
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α和rh IL
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1β，得到诱导体系，培养1天；(4)向步骤(3)所述体系中加入肿瘤抗原多肽，培养1天，获得GMP级别的成熟DC细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，DC细胞培养基为AIM
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V、X
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VIVO或Cell Genix的DC细胞培养基。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，诱导体系中rhIFN
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γ的浓度为0
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50ng/ml，POLYI:C的浓度为1
‑
30μg/ml，rh TNF
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α的浓度为10
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50ng/ml，rh IL
‑
1β的浓度为5
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄英，李波，李娜，胡远，安婷，王俊清，高琰，
申请(专利权)人：深圳吉诺因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：