修饰化外泌体及其制法和外泌体联合PD-1抗体的原位喷雾水凝胶和应用制造技术

一种修饰化外泌体及其制法和外泌体联合PD

【技术实现步骤摘要】
修饰化外泌体及其制法和外泌体联合PD
‑
1抗体的原位喷雾水凝胶和应用


[0001]本专利技术属于药物
，具体涉及修饰化外泌体及其制法和外泌体联合PD
‑
1抗体的原位喷雾水凝胶和应用，特别涉及一种同时载有CpG寡聚脱氧核苷酸和肿瘤特异性蛋白OVA的修饰化外泌体及其制备方法，并涉及外泌体联合PD
‑
1抗体装载于原位喷雾水凝胶在治疗黑色素瘤术后复发中的应用。

技术介绍

[0002]使用单克隆抗PD
‑
1抗体(aPD
‑
1)阻断程序性细胞死亡蛋白1可缓解免疫抑制，并已被证明可以提高一系列癌症的疗效。但免疫检查点阻断的低响应率总会导致术后肿瘤复发和转移。肿瘤浸润树突状细胞(TIDC)和肿瘤引流淋巴结(TDLN)中的树突状细胞通常表现出免疫抑制表型，通常因为它们的不成熟和不活跃状态导致T细胞免疫抑制。此外，在切除的肿瘤中没有足够的活化的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其治疗效果并不令人满意。因此，在两个部位有效双重激活树突状细胞(TIDC和TDLN)以及增加肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以促进全身免疫反应对于黑色素瘤术后免疫治疗至关重要。
[0003]CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN)，是一种Toll样受体9激动剂。CpG寡聚脱氧核苷酸可直接促进树突状细胞成熟和活化，从而诱导Th1型免疫应答，并能促进细胞因子的分泌，产生较强的免疫反应。但是现有的手段难以将CpG寡聚脱氧核苷酸有效地递送至树突状细胞，因此治疗黑色素瘤的效果不佳，并不能够很好的起到抗肿瘤效果。

技术实现思路

[0004]本专利技术所解决的是黑色素瘤术后复发治疗效果并不理想的问题，提供一种修饰化外泌体及其制法和外泌体联合PD
‑
1抗体的原位喷雾水凝胶和应用。外泌体联合PD
‑
1抗体的原位喷雾水凝胶是一种原位可喷的免疫治疗纤维蛋白凝胶，修饰化外泌体实现了双重响应策略，能够同时激活肿瘤浸润处的树突状细胞和引流淋巴结内的树突状细胞，增强了PD
‑
1抗体的作用效果。所制备的外泌体联合PD
‑
1抗体的原位喷雾水凝胶在术后部位形成一个药物储库，逐渐缓慢地释放修饰化外泌体和PD
‑
1抗体，从而增加肿瘤中的T淋巴细胞浸润并提高当前PD
‑
1抗体的疗效。
[0005]本专利技术将CpG寡聚脱氧核苷酸和肿瘤特异性蛋白OVA共载于外泌体上，形成修饰化外泌体，再将修饰化外泌体与PD
‑
1抗体联合装载于由纤维蛋白原和凝血酶构成的喷雾水凝胶中。研究其对于延缓B16
‑
F10
‑
OVA黑色素瘤的生长，巩固全身性T细胞免疫，抑制肿瘤复发和转移，延长小鼠存活期的效果。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术的一种修饰化外泌体，为同时载有CpG寡聚脱氧核苷酸和肿瘤特异性蛋白OVA的外泌体。
[0008]所述的外泌体为树突状细胞衍生的外泌体。
[0009]按比例，产生树突状细胞衍生的外泌体的树突状细胞的个数：肿瘤特异性蛋白OVA为：1
×
106个：200
‑
400μg。
[0010]按质量百分比，CpG寡聚脱氧核苷酸为3％
‑
5％，余量为肿瘤特异性蛋白OVA和外泌体。
[0011]所述的修饰化外泌体的粒径为120
‑
150nm。
[0012]本专利技术的一种修饰化外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0013]S1：收集培养小鼠骨髓来源的并给予OVA刺激的树突状细胞的无血清培养液，通过外泌体提取分离试剂盒除去细胞及细胞碎片，使用PBS重悬后，得到空白的外泌体(DC
‑
sEVs)；
[0014]S2：将CpG ODN与硫醇还原剂混合并充分搅拌，得到混合溶液；
[0015]S3：将胺
‑
巯基交联剂添加到混合溶液中继续搅拌，去除过量的硫醇还原剂和胺
‑
巯基交联剂后，在室温下与DC
‑
sEVs在PBS溶液中孵育，得到修饰化外泌体。
[0016]进一步的，所述的树突状细胞为鼠源性，从C57BL/6小鼠的股骨和胫骨提取而来。所述的给予OVA刺激的树突状细胞的无血清培养液的制备过程为：在含有1
×
106个树突状细胞培养基中，以培养基的体积为基准，添加20ng/mL鼠粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(GM
‑
CSF)，添加5ng/mL白细胞介素
‑
4(IL
‑
4)以及50μM/Lβ
‑
巯基乙醇。在37℃加湿培养箱中培养3天后，用补充有相同体积的GM
‑
CSF和IL
‑
4的新鲜培养基替换。在第6天收集树突状细胞，在含有300μg/mL的OVA的新鲜培养基中孵育过夜。然后加入30ng/mL LPS刺激树突状细胞成熟。随后，使用无血清的培养基培养表达OVA的树突状细胞，收集其培养液。
[0017]所述的硫醇还原剂优选为三(2
‑
羧乙基)膦(TCEP)和/或二硫苏糖醇(DTT)。按摩尔比，CpG ODN：硫醇还原剂＝1：5000。
[0018]所述的胺
‑
巯基交联剂优选为4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo
‑
SMCC)。按摩尔比，CpG ODN：胺
‑
巯基交联剂为1：1.5。
[0019]所述的去除过量的硫醇还原剂和胺
‑
巯基交联剂的方法为：使用3kDa的超滤管超滤除去过量的硫醇还原剂和胺
‑
巯基交联剂。
[0020]本专利技术的一种外泌体联合PD
‑
1抗体的原位喷雾水凝胶，包括原位喷雾水凝胶基质、PD
‑
1抗体(aPD
‑
1)和上述修饰化外泌体，所述的外泌体联合PD
‑
1抗体的原位喷雾水凝胶通过联合PD
‑
1抗体(aPD
‑
1)和上述修饰化外泌体装载于原位喷雾水凝胶基质中制得。
[0021]所述的原位喷雾水凝胶基质由纤维蛋白原和凝血酶组成，当等体积的纤维蛋白原溶液(10mg/mL)与凝血酶溶液(100U/mL)接触时，该基质发生凝胶化，得到原位喷雾水凝胶基质；通过喷雾混合等体积的含有修饰化外泌体的凝血酶溶液和含有PD
‑
1抗体的纤维蛋白原溶液，形成外泌体联合PD
‑
1抗体的原位喷雾水凝胶。
[0022]按固液比，PD
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰化外泌体，其特征在于，该修饰化外泌体为同时载有CpG寡聚脱氧核苷酸和肿瘤特异性蛋白OVA的外泌体。2.根据权利要求1所述的修饰化外泌体，其特征在于，所述的外泌体为树突状细胞衍生的外泌体。3.根据权利要求1所述的修饰化外泌体，其特征在于，按比例，产生树突状细胞衍生的外泌体的树突状细胞的个数：肿瘤特异性蛋白OVA为：1
×
106个：200
‑
400μg；按质量百分比，CpG寡聚脱氧核苷酸为3％
‑
5％，余量为肿瘤特异性蛋白OVA和外泌体。4.权利要求1
‑
3任意一项所述的修饰化外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：收集培养小鼠骨髓来源的并给予OVA刺激的树突状细胞的无血清培养液，通过外泌体提取分离试剂盒除去细胞及细胞碎片，使用PBS重悬后，得到空白的外泌体；S2：将CpG ODN与硫醇还原剂混合并充分搅拌，得到混合溶液；S3：将胺
‑
巯基交联剂添加到混合溶液中继续搅拌，去除过量的硫醇还原剂和胺
‑
巯基交联剂后，在室温下与空白的外泌体在PBS溶液中孵育，得到修饰化外泌体。5.根据权利要求4所述的修饰化外泌体的制备方法，其特征在于，所述的树突状细胞为鼠源性，从C57BL/6小鼠的股骨和胫骨提取而来；所述的给予OVA刺激的树突状细胞的无血清培养液的制备过程为：在含有1
×
106个树突状细胞培养基中，以培养基的体积为基准，添加20ng/mL鼠粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子，添加5ng/mL白细胞介素
‑
4以及50μM/L β
‑
巯基乙醇；在37℃加湿培养箱中培养3天后，用补充有相同体积的GM
‑
CSF和IL
‑
4的新鲜培养基替换；在第6天收集树突状细胞，在含有300μg/mL的OVA的新鲜培养基中孵育过夜；然后加入30ng/mL LPS刺激树突状细胞成熟；随后，使用无血清的培养基培养表达OVA的树突状细胞，收集其培养液。6.根据权利要求4所述的修饰化外泌体的制备方法，其特征在于，所述的硫醇还原剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙进，卢雨彤，王开元，赵健，何仲贵，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：