异源三聚体化融合蛋白、组合物及其应用制造技术

本申请中公开了异源三聚体化融合蛋白、组合物及其应用。该异源三聚体化融合蛋白，即PF

【技术实现步骤摘要】
异源三聚体化融合蛋白、组合物及其应用


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及异源三聚体化融合蛋白、组合物及其应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)的出现，直至现在，仍然对全球公共卫生产生着重大影响。人类对这场突如其来的疫情的研究也进入白热化阶段。
[0003]SARS
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CoV
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2是目前发现的可以感染人类的冠状病毒科中的第七个成员，SARS
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CoV
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2为单股正链RNA，有囊膜，是最大的RNA病毒。SARS
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CoV
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2在入侵人体的时候，棘突糖蛋白(spike蛋白，简称“S蛋白”)发挥着具大作用。S蛋白是一类很大的三聚体跨膜糖蛋白，有着大量糖基化的修饰，其在病毒表面形成特殊的花冠结构，是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(Receptor binding domain，RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件。S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。S蛋白结合细胞表面的受体后，顺势将病毒包膜与细胞膜融为一体，从而将病毒内的遗传物质注入细胞，达到感染细胞的目的。
[0004]当S蛋白与宿主细胞的受体结合后，会造成S1亚基和S2亚基发生解离。S2亚基的构象变为高度稳定的融合后结构，因此S蛋白具有融合前和融合后两种构象。S蛋白与受体细胞融合后，S蛋白多肽处于囊膜最外端的带有免疫抗原决定簇结构部分的RBD由于与受体的结合而移入到下面被遮盖，而非抗原决定簇部分则稳稳地暴露在外端。常规制备的新冠疫苗，即重组的新型冠状病毒S蛋白只会产生融合后的强稳定的构象，这样会大大降低疫苗抗原的免疫原性，从而使疫苗难以发挥作用。
[0005]佐剂，又叫免疫佐剂(immunologic adjuvant)，是指能非特异性地增强或改变机体对匹配抗原的特异性免疫应答，增强抗原的免疫原性或者改变免疫的反应类型，但本身并无抗原性的物质。如灭活病毒疫苗、亚单位疫苗和重组蛋白疫苗，如果疫苗成分里面只有抗原组分，其免疫原性往往不够强，注射到人体可能不能引起足够的免疫反应，就不足以抵抗相应的病原体入侵，因此在应用时，一般需要跟佐剂一起注射，才能起到足够的保护作用。
[0006]目前最常用的佐剂为铝佐剂，主要包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾三种，其中最常用的为氢氧化铝和磷酸铝。铝佐剂广泛用于如HPV疫苗、灭活脊髓灰质炎病毒疫苗、百白破疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、狂犬疫苗、炭疽疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗、b型嗜血杆菌结合疫苗、肺炎链球菌疫苗、脑膜炎疫苗以及兽用疫苗(如口蹄疫病毒疫苗和肉毒杆菌疫苗)等。不同的佐剂对不同疫苗的免疫原性增强效用不同，其对人体的安全性也有所不同，市场上有很多种佐剂品种，筛选出合适的品种也成为目前的研究热点。
[0007]另外，新型冠状病毒目前已突变形成多种变种，Delta菌株和Omicron菌株最为著名，但目前市场上使用的疫苗毒株都还是沿用原始毒株，因此，现有技术提供的疫苗在对抑制Delta菌株和Omicron菌株的作用有限。
[0008]基于上述原因，亟需开发获得结构与性质稳定的，如与宿主细胞受体结合前的病毒表面糖蛋白三聚体结构的重组蛋白，以及选用适用于增强所述重组蛋白在机体内的免疫原性的佐剂，进行开发有效疫苗或药物，抑制或治疗新型冠状病毒肺炎，特别是由Delta菌株和Omicron菌株以及由各自变异菌株引起的新型冠状病毒肺炎，成为解决上述技术问题的关键和难点。

技术实现思路

[0009]多数多聚体蛋白质，其单体都具备一段多肽形成的功能结构域，该功能结构域在构成及稳定蛋白体寡聚化构象起到重要的作用，在形成多聚体蛋白质，如二聚体、三聚体等多聚体蛋白质，所述的功能结构域分同源和异源功能结构域。本申请提供一种以含有异源功能结构域(下称“异源三聚体化结构域”)的蛋白质单体形成的重组融合蛋白，即异源三聚体化融合蛋白。该异源三聚体化融合蛋白具有稳定的蛋白质构象，在此基础上，所述异源三聚体融合蛋白的成功合成为诸如制备有效疫苗抗原或免疫性药物(如抗体药物、功能性细胞因子)来防御或治疗新型冠状病毒肺炎提供了可行性的解决方法。
[0010]结合以上构思，为解决上述部分技术问题，本申请专利技术人提供了异源三聚体化融合蛋白、组合物及其应用。
[0011]第一方面，本申请提供了一种异源三聚体化融合蛋白，即PF
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D三聚体(PF
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D
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Trimer)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；编码异源三聚体化融合蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0012]所述PF
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D三聚体包含重组的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白(重组S蛋白)及异源三聚体化结构域；所述重组S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述重组的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0013]所述重组的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白通过原始的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白突变以及删除其穿膜区片段后获得；所述原始的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5，编码所述原始的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0014]第二方面，本申请提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体表达第一方面所述异源三聚体化融合蛋白。
[0015]进一步地，所述重组表达载体为重组质粒，其包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的核酸分子。
[0016]第三方面，本申请提供一种工程化细胞，其包括第二方面所述重组表达载体。
[0017]第四方面，本申请提供了第一方面所述异源三聚体化融合蛋白的制备方法，其步骤包括：
[0018]构建第二方面所述重组表达载体；
[0019]将所述重组表达载体转染至细胞中，获得工程化细胞；
[0020]培养所述工程化细胞，使其分泌产生蛋白质；以及
[0021]将前述蛋白质分离纯化，获得所述异源三聚体化融合蛋白。
[0022]进一步地，所述蛋白质分离纯化的过程包括：
[0023]制备异源三聚体化结构域单克隆抗体；
[0024]用所述单克隆抗体通过免疫亲和层析捕获异源三聚体化融合蛋白；以及采用切向流过滤(TFF)和纳滤(Poll)处理，获得纯化后的异源三聚体化融合蛋白。
[0025]第五方面，本申请提供一种组合物，其包含权第一方面所述的异源三聚体化融合蛋白及药学上可接受的佐剂。
[0026]进一步地，所述佐剂为CpG1018和氢氧化铝组成。
[0027]进一步地，所述佐剂中CpG1018与氢氧化铝的质量比为2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异源三聚体化融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；编码异源三聚体化融合蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述异源三聚体化融合蛋白包含重组的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白及异源三聚体化结构域；所述重组的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述重组的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述重组的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白通过原始的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白突变以及删除其穿膜区片段后获得；所述原始的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5，编码所述原始的新型冠状病毒Delta菌株S蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。2.一种重组表达载体，其表达权利要求1所述异源三聚体化融合蛋白。3.一种工程化细胞，其包括权利要求2所述重组表达载体。4.权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘滨磊，许雁，诺曼，
申请(专利权)人：武汉滨会生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：