重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途。Fc突变体具有如SEQ ID NO:3～7任一项所示的氨基酸序列；融合蛋白包含：第二肽段，第二肽段为生物活性分子功能区，第三肽段，第三肽段包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或前述的Fc突变体，第二肽段与第三肽段相连。本发明专利技术的Fc突变体为单体形式，融合蛋白具有更高的体内外活性和更低的ADCC、CDC效应，可有效治疗生长激素缺乏症。素缺乏症。

【技术实现步骤摘要】
重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及分子生物学及药物领域，具体地，本专利技术涉及一种重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途，更具体地，本专利技术涉及一种Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途。

技术介绍

[0002]生长激素缺乏症是一种公认的临床综合征，与许多代谢异常相关，包括身体成分异常、体能下降、脂质代谢改变、骨量减少、胰岛素抵抗增加和生活质量降低。大多数与生长激素缺乏症相关的代谢异常可通过重组人生长激素(rhGH)替代物逆转。传统的生长激素缺乏症治疗包括每天皮下注射rhGH，但是，该治疗方法较为繁琐，需每天进行注射，对许多患者来说并不方便，这引起了对治疗依从性差的担忧，这可能导致疗效降低。长效rhGH制剂或长效生长激素制剂不仅可以减少注射次数，提高依从性，还有助于提高GH治疗的疗效。
[0003]因此，仍亟需开发一种新的有效治疗生长激素缺乏症的融合蛋白。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途。本专利技术的Fc突变体易形成单体形式。本专利技术的融合蛋白稳定性强，可有效治疗生长激素缺乏症。
[0005]本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0006]专利技术人通过实验发现，对野生型IgG1的Fc片段的特定位点进行突变，例如，P228 Delete、C229Delete、P230 Delete、T366R、L368H、P395K和K409D/K409T、以及L351S、M428Y和K447A中的至少之一，或者P228 Delete、C229 Delete、T366R、L368H、P395K和K409D或K409T，可使天然二聚体形式的Fc片段表达出来后形成单体形式的Fc突变体。并且，经过实验进一步发现，采用上述Fc突变体与生长激素连接可形成单体形式的融合蛋白，可以通过ProteinA纯化，简化纯化工艺，后续纯化工艺简单。同时，更为重要的是，该融合蛋白获得了更强的人生长激素受体结合活性、促进细胞增值活性和促进报告基因细胞表达荧光素酶活性，以及具有更长的半衰期和更好的体内生物学活性。
[0007]为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种Fc突变体。根据本专利技术的实施例，包括：第一肽段，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：第228位、第229位、第230位、第366位、第368位、第395位和第409位，以及第351位、第428位和第447位中的至少之一；或第228位、第229位、第366位、第368位、第395位和第409位。专利技术人经过大量实验发现，上述突变有利于使天然二聚体形式的Fc片段表达出来后形成单体形式的Fc突变体，采用该单体形式的Fc突变体与生物活性分子融合，后续可通过ProteinA纯化，简化了纯化工艺；同时更为重要的是，采用该Fc突变体制得的融合蛋白具有更高的体内外活性和更低的ADCC、CDC效应。
[0008]需要说明的是，本文中所指的抗体IgG的Fc片段是指抗体IgG的CH2区和CH3区。
[0009]例如，野生型IgG1的Fc片段的氨基酸序列(包括CH2
‑
CH3)如下所示：
[0010]PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:40)。
[0011]野生型IgG1的铰链区(Hinge)的氨基酸序列如下所示：
[0012]DKTHTG(SEQ ID NO:41)。
[0013]野生型IgG1的铰链区(Hinge)的核苷酸序列如下所示：
[0014]GACAAGACACACACCGGA(SEQ ID NO:42)。
[0015]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种融合蛋白。根据本专利技术的实施例，所述融合蛋白包含：第二肽段，所述第二肽段包括生物活性分子功能区；第三肽段，所述第三肽段包括Fc突变体，所述Fc突变体具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或如第一方面所限定的Fc突变体，所述第二肽段与所述第三肽段相连。根据本专利技术实施例的融合蛋白具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应，且后续可通过ProteinA纯化，简化了纯化工艺。
[0016]在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种融合蛋白。根据本专利技术的实施例，所述融合蛋白的结构通式表示为X
‑
L
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Y或Y
‑
L
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X，其中X是第一种生物活性分子；L是不存在或为连接肽；Y是第二种生物活性分子；
‑
为肽键；且所述活性分子X或Y选自蛋白或蛋白结构域、多肽、抗体或抗体片段。
[0017]需要说明的是，所述“X
‑
L
‑
Y”是指X的C端与L的N端相连、L的C端与Y的N端相连；所述“Y
‑
L
‑
X”是指Y的C端与L的N端相连、L的C端与X的N端相连。
[0018]根据本专利技术的实施例，第二方面或第三方面所述的融合蛋白还可以进一步包含如下附加技术特征的至少之一：
[0019]根据本专利技术的实施例，所述融合蛋白为单体形式。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述X为人生长激素。在一些实施例中，所述人生长激素的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:1或者与其具有至少80％
‑
99％同一性的氨基酸序列或者其序列的至少一部分。
[0021]FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:1)。
[0022]根据本专利技术的实施例，所述人生长激素的核苷酸序列包括选自SEQ ID NO:11或者与其具有至少80％
‑
99％同一性的核苷酸序列或者其序列的至少一部分或其序列的密码子优化序列。
[0023]TTTCCCACCATTCCTCTGAGCAGACTGTTCGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Fc突变体，其特征在于，包括：第一肽段，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：第228位、第229位、第230位、第366位、第368位、第395位和第409位，以及第351位、第428位和第447位中的至少之一；或第228位、第229位、第366位、第368位、第395位和第409位；任选地，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：1)第228位、第229位、第230位、第366位、第368位、第395位、第409位和第447位；或，2)第228位、第229位、第230位、第351位、第366位、第368位、第395位、第409位和第428位；或，3)第228位、第229位、第230位、第351位、第366位、第368位、第395位、第409位、第428位和第447位；任选地，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下突变：1)P228 Delete、C229 Delete、P230 Delete、T366R、L368H、P395K、K447A和K409D或K409T；或，2)P228 Delete、C229 Delete、P230 Delete、L351S、T366R、L368H、P395K、M428Y和K409D或K409T；或，3)P228 Delete、C229 Delete、P230 Delete、L351S、T366R、L368H、P395K、M428Y、K447A和K409D或K409T；或4)P228 Delete、C229 Delete、T366R、L368H、P395K和K409D或K409T；任选地，进一步包括：野生型IgG1的铰链区片段，所述野生型IgG1的铰链区片段的C端与所述第一肽段的N端相连；任选地，所述野生型IgG1的铰链区片段具有如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；任选地，所述Fc突变体具有如SEQ ID NO:3～7任一项所示的氨基酸序列；任选地，所述Fc突变体为单体形式。2.一种融合蛋白，其特征在于，包含：第二肽段，所述第二肽段包括生物活性分子功能区；第三肽段，所述第三肽段包括Fc突变体，所述Fc突变体具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或如权利要求1所限定的Fc突变体，所述第二肽段与所述第三肽段相连。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二肽段包含生长激素、生长激素类似物、生长激素功能区或生长激素类似物功能区，优选为人生长激素或人生长激...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦锁富，李娟，周冬梅，游琼英，张伟，
申请(专利权)人：深圳科兴药业有限公司，
类型：发明
国别省市：