用于生产假尿苷单磷酸的融合酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于生产假尿苷单磷酸的融合酶，其特征在于：由核糖激酶基因rbsK

【技术实现步骤摘要】
用于生产假尿苷单磷酸的融合酶及其应用


[0001]本专利技术专利涉及一种用于生产假尿苷单磷酸的融合酶及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]mRNA分子介导的生物疗法是近年来生物医疗研究的一大热点，主要包括了mRNA预防性疫苗、mRNA治疗疫苗及mRNA药物等。与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有生产周期短、作用时间更长等优点。因此在研发上，mRNA疫苗能够快速响应疫情，并且在面对病毒菌株突变也更有优势。2005年Katalin Karik
ó
等人发现了mRNA上存在大量的假尿苷修饰，这种修饰能够大大降低mRNA的免疫原性，避免诱发大量炎症反应，降低mRNA疫苗和药物对人体的副作用。假尿苷、N1
‑
甲基假尿苷、5
‑
甲氧基尿苷等是主要的替换天然尿苷的修饰形式。而假尿苷单磷酸作为主要的合成原料，它的合成生产具有很高的研究价值。
[0003]目前市场上假尿苷单磷酸产品较少，文献记载假尿苷单磷酸的合成方法有化学法和酶法。化学法以假尿苷为底物，步骤较少，但成本较高，并且需要用到易燃易爆的危险品。酶法以D
‑
核糖为底物，成本较低，但需要将合成路径中的多个酶分别构建载体并表达纯化得到酶蛋白，较为复杂。因此，本专利技术通过构建并制备一种融合酶可以简化酶法合成中蛋白表达和纯化的步骤，以快速安全的生产假尿苷单磷酸。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种用于生产假尿苷单磷酸的融合酶。
[0005]本专利技术公开了一种用于生产假尿苷单磷酸的融合酶，由核糖激酶基因rbsK
‑
刚性连接肽
‑
假尿苷5
‘
磷酸糖苷酶基因psuG组成，所述rbsK的序列如SEQ ID No.1所示，所述psuG的序列如SEQ ID No.2所示。
[0006]优选的，所述刚性连接肽的序列为EAAAKEAAAK。
[0007]优选的，所述融合酶的C端还带有His标签。
[0008]本专利技术还公开了上述的用于生产假尿苷单磷酸的融合酶的表达基因，其序列如SEQ ID No.10所示。
[0009]本专利技术还公开了一种用于生产假尿苷单磷酸的融合酶的表达质粒，表达上述的融合酶。
[0010]优选的，质粒载体为PET
‑
28a。
[0011]本专利技术还公开了一种用于生产假尿苷单磷酸的融合酶的原核表达载体，表达上述的融合酶。
[0012]优选的，表达载体为大肠杆菌BL21。
[0013]本专利技术还公开了上述的用于生产假尿苷单磷酸的融合酶的制备方法，其特征在于其步骤包括：
[0014](1)分别进行核糖激酶基因rbsK和假尿苷5
‘
磷酸糖苷酶基因psuG的引物设计，并
且在引物设计过程中加入刚性连接肽和载体的同源片段，以大肠杆菌BL21菌体裂解液为模板，克隆出psuG基因片段及rbsK基因片段；
[0015](2)将步骤(1)的引物克隆出的基因片段连接到质粒载体上，构建PET
‑
rbsK
‑
psuG表达质粒；
[0016](3)将表达质粒转化到大肠杆菌BL21，挑选出阳性克隆以表达融合酶蛋白；
[0017](4)对阳性克隆菌株进行培养，收集菌体，通过超声破碎、离心收集得到总蛋白，然后用Ni
‑
NTA琼脂糖凝胶层析柱进行纯化得到融合酶蛋白。
[0018]优选的，步骤(1)中所述的引物序列为：
[0019]rbsK上游引物：5
’‑
TAAGAAGGAGATATACCATGATGCAAAACGCAGGCAGCC
‑3’
；
[0020]rbsK下游引物：5
’‑
GGAAATTTTTAATTCAGACGCTTTCGCCGCCGCTTCTTTCGCCGCCGCTTCCCTCTGCCTGTCTAAAAATGCGTC
‑3’
；
[0021]psuG上游引物：5
’‑
TCTGAATTAAAAATTTCCCCTGAATTATTACA
‑3’
；
[0022]psuG下游引物：5
’‑
GTGGTGGTGGTGCTCGAGACCCGCGAGACGC
‑3’
。
[0023]优选的，所述质粒载体为PET
‑
28a，步骤(2)具体为将PET
‑
28a用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切产物，将质粒的酶切产物与克隆出的基因片段进行连接，得到rbsK
‑
刚性连接肽
‑
psuG表达质粒
[0024]本专利技术还公开了上述的融合酶在催化D
‑
核糖转化为假尿苷单磷酸中的应用。
[0025]优选的，将D
‑
核糖与融合酶混合进行反应，反应体系包括：ATP 1mM、尿嘧啶1mM、D
‑
核糖1mM、PEP 2mM、融合酶2ug/mL、PK酶2ug/mL，总体积1mL，反应温度37℃。
[0026]本专利技术的有益效果如下：本专利技术的融合酶制备方法简单，成本低，可用于大规模生产。本专利技术的融合酶可以在体外将D
‑
核糖和尿嘧啶催化合成假尿苷单磷酸，大大简化了假尿苷单磷酸及其相关化合物的合成步骤，应用前景广阔。
附图说明
[0027]图1rbsK和psuG基因克隆PCR产物电泳结果。其中泳道1、2为rbsK；泳道4、5为psuG；泳道3是2000bp DNA marker，从上至下依次为2000、1000、750、500、250、100bp。
[0028]图2用本专利技术所述融合酶进行假尿苷单磷酸合成，反应4小时对反应液进行HPLC检测的结果。其中6.3min左右的峰为假尿苷单磷酸。
[0029]图3用本专利技术所述融合酶进行假尿苷单磷酸合成，反应20小时对反应液进行HPLC检测的结果。其中6.3min左右的峰为假尿苷单磷酸。
[0030]图4反应液LC
‑
MS检测的液相结果。图4为结果，1.5min左右的峰为假尿苷单磷酸。
[0031]图5反应液LC
‑
MS检测的MS结果，其中左图为1.11min时的实时结果，右图为1.5min时的实时结果。1.5min左右的峰为假尿苷单磷酸，与图4的结果对应。
具体实施方式
[0032]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。
[0033]实施例1
[0034]本实施例将核糖激酶基因(SEQ ID No.3)、连接肽和假尿苷5
‘
磷酸糖苷酶基因
(SEQ ID No.4)构成的表达元件(SEQ ID No.10)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产假尿苷单磷酸的融合酶，其特征在于：由核糖激酶基因rbsK
‑
刚性连接肽
‑
假尿苷5
‘
磷酸糖苷酶基因psuG组成，所述rbsK的序列如SEQ ID No.1所示，所述psuG的序列如SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述的用于生产假尿苷单磷酸的融合酶，其特征在于：所述刚性连接肽的氨基酸序列为EAAAKEAAAK。3.根据权利要求2所述的用于生产假尿苷单磷酸的融合酶，其特征在于：所述融合酶的C端还带有His标签。4.权利要求1
‑
3中任一项所述的用于生产假尿苷单磷酸的融合酶的表达基因，其序列如SEQ ID No.10所示。5.一种用于生产假尿苷单磷酸的融合酶的表达质粒，其特征在于表达权利要求1
‑
4中任一项所述的融合酶，质粒载体为PET
‑
28a。6.一种用于生产假尿苷单磷酸的融合酶的原核表达载体，其特征在于表达权利要求1
‑
3中任一项所述的融合酶，表达载体为大肠杆菌BL21。7.权利要求1
‑
3中任一项所述的融合酶的制备方法，其特征在于其步骤包括：(1)分别进行核糖激酶基因rbsK和假尿苷5
‘
磷酸糖苷酶基因psuG的引物设计，并且在引物设计过程中加入刚性连接肽和载体的同源片段，以大肠杆菌BL21菌体裂解液为模板，克隆出psuG全长基因片段及rbsK全长基因片段；(2)将步骤(1)的引物克隆出的基因片段连接到质粒载体上，构建rbsK
‑
刚性连接肽
‑
psuG表达质粒；(3)将表达质粒转化到大肠杆菌BL21，挑选出阳性克隆以表达融合酶蛋白；(4)对阳性克隆菌株进行培养，收集菌体，通过超声破碎、离心收集得到总蛋白，然后用N...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖婉莹，滕以刚，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：