一种靶向SIA-IgG的CAR分子和CAR-T细胞及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向SIA

【技术实现步骤摘要】
一种靶向SIA
‑
IgG的CAR分子和CAR
‑
T细胞及应用


[0001]本专利技术涉及免疫学
，具体涉及一种靶向SIA
‑
IgG的CAR分子和CAR
‑
T细胞及应用。

技术介绍

[0002]膀胱癌发病率位居全球恶性肿瘤第十位，然而缺乏有效的治疗手段。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T细胞免疫疗法是目前最有希望攻克肿瘤的疗法之一，在膀胱癌的治疗中有极大的应用前景。
[0003]CAR
‑
T细胞是指通过基因工程使T细胞表达可以识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体。目前最常用的二代CAR的组成包含单链抗体可变片段(Single chain fragment variable,scFv)、铰链区、胞内激活结构域(CD3ζ)，以及一个胞内共刺激结构域(Costimulatory domain,CM)，通常为CD28或4
‑
1BB。在CAR
‑
T的临床治疗中，通常首先收集患者的T细胞，在体外活化T细胞并通过慢病毒或逆转录病毒将CAR转运至T细胞内，即CAR
‑
T细胞，经过大约两周的体外扩增培养，CAR
‑
T细胞会被重新输入至患者体内。
[0004]CAR
‑
T细胞通过scFv识别肿瘤细胞表面抗原，继而被激活，释放大量的细胞因子、穿孔素和颗粒酶等，最终诱导对肿瘤细胞的细胞毒性杀伤。CAR
>‑
T细胞杀伤效果强，杀伤肿瘤特异性好，然而目前膀胱癌缺乏CAR
‑
T治疗有效且特异的靶点，多数膀胱癌相关抗原往往在正常组织中也有一定程度的表达，难以避免CAR
‑
T治疗膀胱癌过程中对正常组织的损伤。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种靶向SIA
‑
IgG的CAR分子和CAR
‑
T细胞及应用，该CAR
‑
T细胞对膀胱癌细胞的特异性强，能够避免对正常组织的损伤。
[0006]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0007]本专利技术第一方面提供一种靶向SIA
‑
IgG的CAR分子，所述CAR分子包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其特征在于，所述胞外段包括scFv，所述scFv包括VH、VL以及连接VH和VL的linker，所述VH序列如SEQ ID NO.1所示，所述VL序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]优选地，所述scFv中VH在前，VL在后；所述linker序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]优选地，所述胞内段包括胞内共刺激结构域，所述胞内共刺激结构域为CD28或4
‑
1BB。
[0010]优选地，所述胞外段还包括Hinge，所述scFv通过Hinge与跨膜段连接。
[0011]本专利技术第二方面提供一种靶向SIA
‑
IgG的CAR
‑
T细胞，所述CAR
‑
T细胞包括上述CAR分子。
[0012]本专利技术中CAR分子包含单链抗体可变片段(Single chain fragment variable,scFv)、铰链区(Hinge)、胞内激活结构域(CD3ζ)，以及一个胞内共刺激结构域(Costimulatory domain,CM；如4
‑
1BB或CD28)。scFv由单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)通过多肽(Linker)连接组成，可特异性识别肿瘤相关抗原；铰链区的长度由抗原表位的位
置及暴露程度决定；CD3ζ提供T细胞活化的第一信号，CM提供T细胞活化的第二信号。
[0013]CAR
‑
T细胞通过scFv识别肿瘤细胞表面抗原，继而被激活，CAR分子在T细胞膜上聚集和固定，形成免疫突触，CD3ζ链上的免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine
‑
based activation motif,ITAM)磷酸化并通过70kDa酪氨酸激酶相关蛋白(ZAP70)等启动下游信号传递，释放大量的细胞因子、穿孔素、颗粒酶等，最终诱导对肿瘤细胞的细胞毒性杀伤。
[0014]本专利技术第三方面提供一种上述CAR
‑
T细胞的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
[0015](a)采用密度梯度离心法从健康者或膀胱癌患者的血液中富集得到T细胞；
[0016](b)采用分子克隆技术将scFv序列连接到CAR载体上，得到CAR分子；
[0017](c)采用慢病毒将CAR分子转入T细胞中，即得所述CAR
‑
T细胞。
[0018]优选地，所述CAR载体为二代CAR载体。
[0019]本专利技术第四方面提供一种上述CAR分子或CAR
‑
T细胞在制备抗肿瘤制剂中的应用。
[0020]优选地，所述肿瘤为膀胱癌。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少包括：
[0022]本专利技术靶向膀胱癌的CAR
‑
T细胞，对膀胱癌的杀伤效果良好，而且比目前存在的靶向HER2的CAR
‑
T细胞对膀胱癌的杀伤特异性更强，能够避免对正常组织的损伤。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
[0024]图1为本专利技术实施例2中构建的四种靶向SIA
‑
IgG的CAR
‑
T细胞的结构及CAR的病毒转染效率；
[0025]图2为本专利技术实施例3中激光共聚焦显微镜观察SIA
‑
IgG
‑
CAR在T细胞膜上分布情况以及激光共聚焦显微镜下CAR分子在Jurkat细胞与肿瘤细胞的接触面聚集情况；
[0026]图3为本专利技术实施例4中荧光倒置显微镜下不同CAR
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T细胞对膀胱癌细胞5637及成纤维细胞SC2的杀伤情况；
[0027]图4为本专利技术实施例4中荧光素酶检测不同CAR
‑
T细胞对膀胱癌细胞5637及成纤维细胞SC2的杀伤效率；
[0028]图5为本专利技术实施例5中荧光倒置显微镜下PBMC、SIA
‑
IgG
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CAR
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T和HER2
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CAR
‑
T细胞对SV
‑
HUC
‑
1、HK
‑
2、293T的杀伤情况；
[0029]图6为本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向SIA
‑
IgG的CAR分子，所述CAR分子包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其特征在于，所述胞外段包括scFv，所述scFv包括VH、VL以及连接VH和VL的linker，所述VH序列如SEQ ID NO.1所示，所述VL序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的CAR分子，其特征在于，所述scFv中VH在前，VL在后；所述linker序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的CAR分子，其特征在于，所述胞内段包括胞内共刺激结构域，所述胞内共刺激结构域为CD28或4
‑
1BB。4.根据权利要求1所述的CAR分子，其特征在于，所述胞外段还包括Hinge，所述scFv通过Hinge与跨膜段连接。5.一种靶向SIA
‑
IgG...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱晓彦，徐涛，魏平，丁梦婷，秦彩朋，
申请(专利权)人：丁梦婷，
类型：发明
国别省市：