一种用于精准调控巨噬细胞极化的重组仿生多肽纳米材料及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于精准调控巨噬细胞极化的重组仿生多肽纳米材料及其应用，涉及生物工程领域。本发明专利技术制备的一种能够自组装成纳米纤维的重组仿生多肽，自组装成重组仿生多肽材料，其能够特异性激活巨噬细胞，使其发生M1型极化，并且极化的巨噬细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用，因此有望应用于肿瘤免疫治疗。因此有望应用于肿瘤免疫治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种用于精准调控巨噬细胞极化的重组仿生多肽纳米材料及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种用于精准调控巨噬细胞极化的重组仿生多肽纳米材料及其应用。

技术介绍

[0002]巨噬细胞是肿瘤免疫治疗的双刃剑。巨噬细胞在免疫和肿瘤治疗中表现为促炎和抗炎表型，促炎型巨噬细胞称为M1型，通过分泌趋化因子IL6、TNFα等抑制肿瘤生长并促进癌症治疗；而抗炎型巨噬细胞称为M2型，分泌抗炎型细胞因子，在肿瘤微环境中促进其生长及转移。最近，生物材料作为局部生态位免疫调节剂的出现促进了通过定制的机械，化学和免疫反应特性与宿主相互作用的纳米材料的设计。因此，激活所需的巨噬细胞表型对于在肿瘤治疗中获得更积极的作用至关重要。
[0003]据报道，不同的纳米材料作为免疫调节剂具有显着的作用。金属纳米颗粒，如Au，Ag，Co，ZnO，TiO2增强巨噬细胞极化，在不同细胞类型如RAW264.7和J774.A1中显示出细胞因子IL
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6，IL
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1β和TNFα表达水平的升高，即促进巨噬细胞从M0到M1过渡的作用。此外，SiO2、费鲁莫羟醇纳米颗粒和GO纳米片的诱导也观察到了M0到M1的表型转变。然而，具有Ca和Sr表面涂层的无机纳米颗粒Ti促进J774.A1细胞M0至M2极化表型，伴随Arg1、MR、CD163的表达变化；hGM
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PMMA30纳米颗粒通过包合素和卡维啉依赖性途径内吞，触发M2极化和M1至M2切换。相比之下，有机纳米材料如糖基物质、SPION、HA/>‑
PEI聚合物和海藻酸盐基纳米球增加了THPl衍生的M2巨噬细胞和J774.A1细胞从M1到M2的转变。
[0004]然而，不同的金属纳米颗粒对M0至M1巨噬细胞活化表现出不同的作用，但在生物医学应用中仍面临金属毒性、生物相容性低、细胞代谢消融障碍、免疫调节剂窗口窄等挑战。Ag纳米颗粒表现出大小依赖性细胞毒性，改变细胞抗氧化剂的水平并阻止细胞周期，从而降低成骨细胞和破骨细胞的活力和分化。ZnO纳米颗粒降低细胞活力，诱导ER应激，细胞凋亡和细胞周期改变。这些导致基因毒性，包括人类神经元细胞中的微核形成，γH2AX磷酸化和DNA损伤。TiO2纳米颗粒暴露于大鼠中，通过诱导一氧化氮合酶的上调诱导新生儿海马神经元凋亡，该合成酶在氧化应激和炎症中起重要作用。所以，有必要设计和合成一类新的基于纳米颗粒的免疫调节剂来克服短缺。
[0005]蛋白质或多肽被认为是纳米颗粒制备的理想材料，因为这些天然分子具有生物相容性、可生物降解和可代谢性。疫苗支架、纳米材料等基于新型蛋白质结构的蛋白质设计最新进展正在扩大多肽的生物官能度和生物医学应用。此外，AlphaFold2、RoseTTAFold、trRosetta、t
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Fold等基于机器智能的蛋白质结构计算越来越多地支持从头设计。通过利用许多高分辨率的从头蛋白质结构，这些工具现在已经通过从氨基酸序列预测3D结构来确定，并促进基于蛋白质的基于蛋白质的纳米材料设计。由于最近纳米调节剂在局部生态位方面的进展对基于多肽的纳米材料的报道非常有限，本研究旨在设计和合成一种具有可编程自组装模式的多肽基纳米材料，该纳米材料可以在肿瘤治疗中精确地重置巨噬细胞免疫
反应。

技术实现思路

[0006]申请人基于蜘蛛丝蛋白设计并制造了一种定制的自组装蛋白，可以精确地重置巨噬细胞免疫反应。结合计算研究，通过纳米表征实验揭示了从单体到多体基纳米纤维的自组装机理。该物质能将肿瘤相关巨噬细胞免疫应答精确极化为M1表型，M1表型一般被认为是杀伤肿瘤巨噬细胞，主要是抗肿瘤和免疫促进，在肿瘤治疗中达到更积极的作用。该研究提供了一种创新的基于多肽的纳米材料，其应有可能推进癌症免疫治疗的应用。
[0007]在本专利技术，将“自组装”基序与“细胞外基质”基序组合成融合蛋白。通过利用丝蛋白的自组装序列和整合素识别基序，采用蜘蛛丝的自组装序列(GGSGGOGGGOASAAABSARATSBSP)n作为重复结构域的自组装模量。同时，在C端定制了RGD和IKVAV作为细胞外基质基序用于整合素识别。由于整合素β参与可以诱导NF
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κB的活化，其促进炎性细胞因子的表达，从而导致巨噬细胞的促炎极化(M1)，而层粘连蛋白衍生的IKVAV肽促进有益的细胞相互作用并减弱细胞接触反应。
[0008]本专利技术提供了一种用于诱导巨噬细胞M1型极化的重组仿生多肽，所述重组仿生多肽包括若干个核心基序和用于整合素识别的多肽；
[0009]所述核心基序包括来源于斑络新妇(Nephila pilipes)的富含丝氨酸的模块和富含甘氨酸的基序；
[0010]所述富含丝氨酸的块的氨基酸序列为ASAAANSASRATSNS，所述富含甘氨酸的基序的氨基酸序列为GGSGGPGGG。
[0011]优选的，所述若干个核心基序的数量为2～8个。更为优选的，所述若干个核心基序的数量为8个。当核心基序的数量为8个的时候，自组装形成纳米纤维的效果最好。
[0012]所述核心基序还包括用于拓扑结构和稳定性控制的基序；所述用于拓扑结构和稳定性控制的基序的氨基酸序列为P。序列中间添加脯氨酸用于蛋白质折叠过程中的拓扑结构和稳定性控制。
[0013]优选的，所述用于整合素识别的多肽包括氨基酸序列为RGD的多肽、氨基酸序列为IKVAV的多肽和氨基酸序列为YIGSR中的至少一种。更为优选的，所述用于整合素识别的多肽包括氨基酸序列为RGD的多肽和氨基酸序列为IKVAV的多肽。该多肽序列和整合素的特异性几乎和粘附蛋白的作用一样。
[0014]所述重组仿生多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0015]本专利技术还提供了一种用于诱导巨噬细胞M1型极化的重组仿生多肽纳米材料(BMPP)，所述重组仿生多肽纳米材料由所述的重组仿生多肽自组装而成，所述重组仿生多肽纳米材料具有纤维状结构。EdU细胞增殖实验表明该BMPP不显著影响巨噬细胞增殖，可以诱导巨噬细胞细胞核增大、细胞骨架的面积及纤维数量增大。一氧化氮合酶NOS2、白细胞介素IL6、肿瘤坏死因子TNFα的表达升高提示BMPP特异性诱导巨噬细胞的M1型极化。
[0016]本专利技术还提供了所述的重组仿生多肽纳米材料的制备方法，将所述的重组仿生多肽溶解于pH＝8.0的200mM磷酸钾缓冲液，搅拌得到所述的重组仿生多肽纳米材料。
[0017]本专利技术还提供了所述的重组仿生多肽纳米材料在制备抗肿瘤药物中的应用。结合细胞活性染色检测极化的巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，结果显示M1极化的巨噬细胞对
肿瘤细胞具有一定杀伤作用。
[0018]本专利技术还提供了一种药物，活性成分包含所述的重组仿生多肽纳米材料。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]本专利技术制备的一种能够自组装成纳米纤维的重组仿生多肽，自组装成重组仿生多肽材料，其能够特异性激活巨噬细胞，使其发生M1型极化，并且极化的巨噬细胞对肿瘤细胞具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于精准调控巨噬细胞极化的重组仿生多肽，其特征在于，所述重组仿生多肽包括若干个核心基序和用于整合素识别的多肽；所述核心基序包括来源于斑络新妇(Nephilapilipes)的富含丝氨酸的模块和富含甘氨酸的基序；所述富含丝氨酸模块的氨基酸序列为ASAAANSASRATSNS，所述富含甘氨酸的基序的氨基酸序列为GGSGGPGGG。2.如权利要求1所述的重组仿生多肽，其特征在于，所述若干个核心基序的数量为2～8个；优选地，核心基序的数量为8个。3.如权利要求1所述的重组仿生多肽，其特征在于，所述核心基序还包括用于拓扑结构和稳定性控制的基序；所述用于拓扑结构和稳定性控制的基序的氨基酸序列为P。4.如权利要求1所述的重组仿生多肽，其特征在于，所述用于整合素识别的多肽包括氨基酸序列为RGD的多肽、氨基酸序列为IKVAV的多肽和氨基酸序列为YIGSR中的至少一种。...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚远，马红茹，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：