一种双启动子质粒及其构建方法和应用技术

本申请公开了一种双启动子质粒及其构建方法和应用。该质粒包括：真核CMV启动子、核糖体结合位点、T7 RNA聚合酶基因、T7启动子、多聚腺嘌呤核苷酸序列、牛生长激素多腺苷酸化信号序列以及目的基因。该质粒载体进入肿瘤细胞后，首先由CMV启动子启动T7 RNA聚合酶基因转录，翻译产生T7 RNA聚合酶，所述T7 RNA聚合酶识别质粒上的T7启动子，转录目的基因翻译成蛋白质。质粒载体通过与目标基因精确结合，并载入表达系统，获得更高表达量的目标蛋白。获得更高表达量的目标蛋白。获得更高表达量的目标蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种双启动子质粒及其构建方法和应用


[0001]本申请涉及质粒构建
，尤其涉及一种双启动子质粒、构建方法及其应用，更具体的是，通过所构建的双启动子质粒瘤内表达细胞因子抑制肿瘤生长。

技术介绍

[0002]载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。主要包括已有载体多克隆位点（MCS）的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。是为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体，载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
[0003]现有技术中，利用基因工程制备重组免疫蛋白时，通过应用质粒中CMV promoter（巨细胞病毒启动子）等强启动子的在真核表达系统（如肿瘤细胞）里表达获得相关免疫蛋白，这种方法具有表达量较低、获得的重组蛋白含量少、成本较高等问题。
[0004]因此，亟需构建一种质粒载体，该质粒载体通过与目标基因精确结合，并载入表达系统，获得更高表达量的目标蛋。

技术实现思路

[0005]针对以上技术问题，本申请构思在于，提供一种连续双启动子质粒，优化基因的表达结构，即构建区别于现有技术的重组质粒结构，使其在表达系统中能够更高量地表达目标蛋白。
[0006]结合以上构思，本申请提供了一种具备双启动子的全新结构的质粒载体，所述质粒载体进入肿瘤细胞后，首先由巨细胞病毒（下简称“CMV”）启动子启动T7 RNA聚合酶基因转录，翻译产生的T7 RNA聚合酶，所述T7 RNA聚合酶识别质粒上的T7启动子，转录目的基因（GOI)翻译成蛋白质，由于，利用T7 RNA聚合酶对T7启动子转录具有一个放大的作用，因此，所述质粒在进入肿瘤细胞后可以产生更多量的目标蛋白。
[0007]第一方面，本申请实施例公开了一种质粒，所述质粒包括：CMV启动子；所述的CMV启动子序列如SEQ ID NO：1所示；核糖体结合位点(IRES)；所述IRES的序列如SEQ ID NO：2所示；T7 RNA聚合酶基因；所述T7 RNA聚合酶基因的序列如SEQ ID NO：3所示；T7启动子；所述T7启动子的序列如SEQ ID NO：4所示；多聚腺嘌呤核苷酸(pA)序列；所述pA序列为多个腺嘌呤A连在一起组成的RNA序列；牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA)序列；所述BGHpA序列如SEQ ID NO：5所示；以及目的基因（GOI)。
[0008]进一步地，在构建的质粒中，T7 RNA聚合酶基因序列位于真核CMV启动子下游，
BGHpA序列位于T7 RNA聚合酶基因下游，T7启动子位于BGHpA序列下游，IRES的序列位于T7启动子下游，目的基因（GOI)位于IRES下游。
[0009]进一步地，在构建上述质粒过程中，原核表达的T7启动子来源于T7噬菌体，是一种大肠杆菌表达系统常用的强启动子，它能够对T7 RNA聚合酶有特异性反应，被识别后的转录非常活跃；CMV启动子作为增强子/启动子元件，这类元件来源于病毒基因组，CMV启动子是公认的启动真核基因表达最有力量的启动子，在很多真核细胞中都有很强的促进转录的作用，启动效率比较高；IRES能够介导不依赖末端的翻译启始过程，IRES可在同一个启动子下，表达两个乃至更多基因；因此，通过在目的基因（GOI)的上游插入IRES序列将能引导T7RNAP/启动子转录的mRNA在真核细胞中翻译，重组载体中CMV启动子启动T7 RNA聚合酶基因转录，翻译产生的T7RNA聚合酶，识别质粒上的T7启动子，转录目的基因（GOI)翻译成蛋白质。
[0010]进一步地，牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA)序列作为转录T7 RNA聚合酶基因的终止子序列。
[0011]第二方面，本申请实施例公开了前述质粒的构建方法，所述方法包括以下步骤：合成目的基因（GOI)；构建含有目的基因（GOI)的第一重组真核表达质粒；将CMV启动子、核糖体结合位点(IRES)、T7 RNA聚合酶基因、多聚腺嘌呤核苷酸(pA)序列及牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA)序列序列重组至第一重组真核表达质粒，获得第二重组真核表达质粒；对所述第二重组真核表达质粒进行筛选，验证，即获得前述质粒。
[0012]进一步地，合成目的基因（GOI)的方法包括化学合成法、PCR扩增法中的至少一种。
[0013]第三方面，本申请实施例公开了一种前述质粒在肿瘤药物中的应用。
[0014]第四方面，本申请实施例公开了一种前述质粒在制备mRNA药物的应用。
[0015]第五方面，本申请实施例公开了一种药物，其药物的有效成份包含前述质粒及用于药物组合的辅料。
[0016]进一步地，所述质粒包含的目的基因（GOI)为mGM
‑
CSF基因。
[0017]第六方面，本申请实施例公开了前述质粒在肿瘤细胞的应用。
[0018]第七方面，本申请实施例公开了前述药物在肿瘤细胞的应用。
[0019]第八方面，本申请实施例公开了一种重组细胞，所述重组细胞包含前述质粒。
[0020]第九方面，本申请实施例公开了一种基因工程菌，所述基因工程菌包含第八方面所述重组细胞。
[0021]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：本申请中涉及一种双启动子质粒、构建方法及其应用，所述质粒包括：真核CMV启动子、核糖体结合位点(IRES)、T7 RNA聚合酶基因、T7启动子、多聚腺嘌呤核苷酸(pA)序列、牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA)序列以及目的基因（GOI)。所述质粒载体进入肿瘤细胞后，首先由CMV启动子启动T7 RNA聚合酶基因转录，翻译产生的T7 RNA聚合酶，所述T7 RNA聚合酶识别质粒上的T7启动子，转录目的基因（GOI)翻译成蛋白质。所述质粒载体通过与目
标基因精确结合，并载入表达系统，获得表达量更高的目标蛋白。
附图说明
[0022]图1为本申请实施例提供的重组质粒表达结构示意图。
[0023]图2为本申请实施例提供的小鼠肿瘤体积平均趋势图。
[0024]图3为本申请实施例提供的小鼠第21天肿瘤平均体积变化图。
[0025]图4为本申请实施例提供的活体成像观察小鼠荧光信号图。
具体实施方式
[0026]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0027]在本申请中，术语“基因”指表达特定蛋白质或功能RNA分子的核酸片段，该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5
′
非编码区)和之后的调节序列(3
′
非编码区)。“元件”是指(upstream promoter elements)包括通常位于
‑
70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种质粒，其中，所述质粒包括：CMV启动子；所述的CMV启动子序列如SEQ ID NO：1所示；核糖体结合位点；所述核糖体结合位点的序列如SEQ ID NO：2所示；T7 RNA聚合酶基因；所述T7 RNA聚合酶基因的序列如SEQ ID NO：3所示；T7启动子；所述T7启动子的序列如SEQ ID NO：4所示；多聚腺嘌呤核苷酸序列；所述多聚腺嘌呤核苷酸序列为多个腺嘌呤A连在一起组成的RNA序列；牛生长激素多腺苷酸化信号序列；所述牛生长激素多腺苷酸化信号序列如SEQ ID NO：5所示；以及目的基因。2.权利要求1所述的质粒，其中，T7 RNA聚合酶基因序列位于真核CMV启动子下游，牛生长激素多腺苷酸化信号序列位于T7 RNA聚合酶基因下游，T7启动子位于牛生长激素多腺苷酸化信号序列下游，核糖体结合位点位于T7启动子下游，目的基因位于核糖体结合位点下游。3.权利要求1或2任一项质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘滨磊，蔡林康，
申请(专利权)人：武汉滨会生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：