斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法和应用，包括：确定hoxbb基因簇的敲除靶点分别位于hoxb1b基因的第1个外显子上和hoxb8b基因的第1个外显子上设计gRNA序列，以gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化、体外转录获得gRNA，将hoxb1b和hoxb8b的gRNA与Cas9mRNA混合共同注射导入斑马鱼受精卵中，培养获得稳定遗传的hoxbb基因簇缺失突变体。本发明专利技术通过基因组上多个连续基因共同敲除并获得稳定突变体提供方式方法，同时斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的表型为研究hoxbb基因簇的生物学功能及与hoxbb基因簇缺失相关的疾病奠定基础。疾病奠定基础。疾病奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统有三种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas系统只需要一个Cas9核酸内切酶切割DNA双链，即CRISPR/Cas9系统。作为一种新型基因组编辑技术，CRISPR/Cas9系统具有实验简单、操作容易、节省时间等优点。利用CRISPR/Cas9技术已在小鼠、拟南芥、果蝇等多个物种中实现基因定向改造。在斑马鱼研究领域，该技术也被广泛应用于精确和靶向性的基因编辑，成为一种高效便捷的基因编辑工具。
[0003]Hox基因是一大类含有同源框的转录因子家族，全名同源异型基因。它们在染色体上成簇地排列，分布在不同的染色体上。Hox基因家族在早期胚胎发育过程中控制着身体形态的构建。Hox基因产生突变常常会导致身体的对应部位产生相应的畸形。Hox基因最早在果蝇中被发现，只含有一个基因簇。大多数脊椎动物在进化过程中经历了的基因组加倍，Hox基因在这个过程中也发生了加倍过程。其中大多数硬骨鱼包括模式动物斑马鱼经历了额外的一次基因组加倍，最终形成7
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8个基因簇。在斑马鱼中含有7个hox基因簇，共有48个基因。例如，在小鼠中的Hoxb基因簇在斑马鱼中有两个：hoxba基因簇和hoxbb基因簇。r/>[0004]据报道显示，Hox基因不但在前后轴形成及体节发育过程中起作用，还在脊椎动物心脏发育形成时起到重要作用。其中，HOXB基因簇的杂合缺失患者在包括心房和心室间隔缺损在内的多个器官中表现出异常。近年来已有部分关于Hoxb基因簇的报道，起初是Olga Medina
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Martinez等人在小鼠中对Hoxb1
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Hoxb9 9个基因进行删除后发现：Hoxb1
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Hoxb9基因删除后的杂合子小鼠没有出现缺陷表型，纯合突变体小鼠出现了水肿，颈部出血等心血管疾病。后续论文有报道Hoxb突变体小鼠的心脏和大动脉在大小和形态上出现了缺陷，相继也出现了胸骨发育缺陷等多种表型。在小鼠中，关于单个Hoxb基因已有一些报道，但由于一些局限性，研究机制尚未明确。在斑马鱼中，hoxbb基因簇对心脏发育的调控机制是如何实现的，目前也没有明确报道。斑马鱼中的hoxbb簇由四个hoxb基因(hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b)组成，横跨12号染色体3
′
至5
′
约25.5kb。为了研究hoxbb簇在心脏发育过程中的功能，并模拟人类中HOXB簇缺失相关的del[17](q21.3q23)疾病(Amores A等，1998；Pearson,Lemons and McGinnis，2005)，我们通过使用CRISPR/Cas9系统在斑马鱼中创建了整个hoxbb簇的大片段缺失，进而对该疾病模型的致病机制展开研究。
[0005]另外，现有技术中大片段敲除技术相对难度较高、效率较低。2010年，Jin
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Soo Kim实验室利用锌指核酸酶成功地在人的293T细胞上实现了大片段敲除，其敲除效率在2％～5％之间。在2013年，Scot A.Wolfe实验室利用TALEN技术在斑马鱼中成功实现了大片段的敲除，其敲除效率在1％～15％之间不等。与此同时，有研究报道利用CRISPR/Cas9技术对斑
马鱼进行大片段删除，删除的片段大小在0.2kb～120kb之间的范围内，其片段删除效率在0～1/3之间。利用CRISPR/Cas9技术结合分子生物学技术，创建hoxbb基因大片段高效删除方法及应用，有助于弥补该基因簇在心脏疾病研究技术上的空白。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于提供斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法，利用斑马鱼这一模式生物，通过CRISPR/Cas9技术对hoxbb基因簇进行基因编辑，实现目的基因的定位敲除，获得斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体，为基因组上多个连续基因共同敲除并获得稳定突变体提供方式方法。
[0007]本专利技术的另一目的是提供斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体作为动物模型在研究hoxbb基因簇的生物学功能及模拟人类中HOXB簇缺失相关的del[17](q21.3q23)疾病，为人类中hoxbb簇导致的心脏机制的探索提供理论基础。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术提供斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法，包括以下步骤：
[0010]S1、确定hoxbb基因簇两端的靶点位置，在hoxb8b起始密码子前和hoxb1b终止密码子后分别设计靶点gRNA序列；
[0011]S2、设计并合成两对gRNA的上游引物T7
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hoxb8b
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sfd、上游引物T7
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hoxb1b
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sfd和下游引物tracrrev；
[0012]S3、以gRNA骨架质粒为模板，使用引物T7
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hoxb8b
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sfd、T7
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hoxb1b
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sfd和下游引物tracrrev进行PCR扩增；
[0013]S4、对步骤S3的PCR产物分别进行体外转录，转化获得hoxb8b
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gRNA和hoxb1b
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gRNA；
[0014]S5、将上述纯化后的gRNA和Cas9 mRNA显微注射到斑马鱼单细胞的胚胎中，培养24h后提取DNA，在hoxb8b靶点两侧和hoxb1b靶点两侧分别设计两对检测引物，利用双外侧引物PCR的方法进行检测，确定hoxbb基因簇敲除阳性F0养至成鱼；
[0015]S6、步骤S5筛选获得的可遗传的亲本F0外交获得稳定遗传的F1养殖至性成熟，在F1内交鱼中得到1/4F2纯合突变体，通过对F2斑马鱼剪尾检测并进行测序验证，在F2代获得稳定遗传的斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体。
[0016]作为优选，步骤S1中，所述靶点gRNA序列为
[0017]hoxb8b：GGGAGTTCTCGGAGGTAGAG(SEQ ID NO:1)；
[0018]hoxb1b：GGAATGTTGCATTACACACC(SEQ ID NO:2)。
[0019]作为优选，步骤S2中，上游引物F1(T7+Target site+)，即引物T7
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hoxb8b
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sfd的序列为
[0020][0021]引物T7
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hoxb1b
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sfd的序列为
[0022][0023]下游引物R1(trans reverse)，即gRNA反向引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、确定hoxbb基因簇两端的靶点位置，在hoxb8b起始密码子前和hoxb1b终止密码子后分别设计靶点gRNA序列；S2、设计并合成两对gRNA的上游引物T7
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hoxb8b
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sfd、上游引物T7
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hoxb1b
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sfd和下游引物tracrrev；S3、以gRNA骨架质粒为模板，使用引物T7
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hoxb8b
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sfd、T7
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hoxb1b
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sfd和下游引物tracrrev进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物分别进行体外转录，转化获得hoxb8b
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gRNA和hoxb1b
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gRNA；S5、将上述纯化后的gRNA和Cas9 mRNA显微注射到斑马鱼单细胞的胚胎中，培养24h后提取DNA，在hoxb8b靶点两侧和hoxb1b靶点两侧分别设计两对检测引物，利用双外侧引物PCR的方法进行检测，确定hoxbb基因簇敲除阳性F0养至成鱼；S6、步骤S5筛选获得的可遗传的亲本F0外交获得稳定遗传的F1养殖至性成熟，在F1内交鱼中得到1/4F2纯合突变体，通过对F2斑马鱼剪尾检测并进行测序验证，在F2代获得稳定遗传的斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体。2.根据权利要求1所述斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，hoxb8b的靶点gRNA序列如SEQ ID NO:1所示，hoxb1b的靶点gRNA序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，上游引物T7
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hoxb8b
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sfd、T7
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hoxb1b
...

【专利技术属性】
技术研发人员：祖尧，王冰琦，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：