一种用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒及其构建方法和应用。本发明专利技术的用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒包括骨架序列和插入序列，所述插入序列依次包括蓝色荧光序列BFP、连接元件T2A、红色荧光序列mCherry、不完整的绿色荧光序列GFPHDR和STgRNA序列。本发明专利技术的双报告质粒在发生单碱基编辑和同源重组时，报告质粒的荧光会发生变化，从而保证基因编辑载体进入细胞后仍然具有较高的编辑活性，同时由于对同源重组和单碱基编辑均可以进行报告，提高了报告质粒的适用范围。告质粒的适用范围。告质粒的适用范围。

【技术实现步骤摘要】
一种用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]基因编辑是指对基因组进行定点修饰的技术。利用该技术可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段。基因编辑技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。目前主要基因编辑技术分别为人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc
‑
finger nucleases，ZFN)技术、转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator
‑
like effector nucleases，TALEN)技术和RNA引导的CRISPR
‑
Cas核酸酶技术(CRISPR
‑
Cas RGNs)。
[0003]现有技术中，同源重组和单碱基编辑的细胞筛选策略主要是基于基因编辑载体的筛选标记，通过药物或荧光筛选后进行基因编辑检测。但是，如果同时转入几个载体，筛选出来的细胞只能保证基因编辑载体进入细胞，并不能保证筛选获得的细胞符合预期的编辑效果，如否具有较高的编辑活性，且，在基因组一个位点发生基因编辑后在另一个位点发生基因编辑的效率也会大大提升，导致筛选出来的细胞仍然有很多是阴性的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒及其构建方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒，包括骨架序列和插入序列，所述插入序列依次包括蓝色荧光序列BFP、连接元件T2A、红色荧光序列mCherry、不完整的绿色荧光序列GFPHDR和gRNA序列。
[0007]本专利技术的双报告质粒在发生单碱基编辑和同源重组时，报告质粒的荧光会发生变化，从而保证基因编辑载体进入细胞后仍然具有较高的编辑活性，同时由于对同源重组和单碱基编辑(如C变T)均可以进行报告，提高了报告质粒的适用范围。
[0008]作为本专利技术所述的用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒的优选实施方式，所述STgRNA的靶基因的序列如SEQ ID No.1所示；所述BFP序列第一部分如SEQ ID No.2所示；所述BFP序列第二部分如SEQ ID No.3所示；所述mCherry序列如SEQ ID No.4所示；所述GFPHDR如SEQ ID No.5所示。
[0009]作为本专利技术所述的用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒的优选实施方式，所述骨架序列来自表达载体为pCEP4。
[0010]第二方面，本专利技术提供了所述的用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒的构建方法，包括以下步骤：
[0011](1)将骨架表达载体双酶切；
[0012](2)分别酶切PCR扩增后的BFP基因、mCherry基因、不完整的GFPHDR基因和靶基因；
[0013](3)将步骤(1)所述酶切后回收的片段与步骤(2)所述酶切后回收的片段连接，即成。
[0014]作为本专利技术所述的用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒的构建方法的优选实施方式，所述PCR扩增的引物序列如SEQ ID No.6～16所示。
[0015]第三方面，本专利技术提供了一种表达宿主菌，包括所述的用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒。
[0016]第四方面，本专利技术提供了所述的双报告质粒、所述的制备方法、所述的表达宿主菌在同时报告细胞中同源重组和单碱基编辑中的应用。
[0017]作为本专利技术所述的应用的优选实施方式，将所述双报告质粒与质粒px459和/或pCMV
‑
BE4max
‑
P2A
‑
Puro共转染所述细胞。
[0018]作为本专利技术所述的应用的优选实施方式，所述双报告质粒与质粒px459或pCMV
‑
BE4max
‑
P2A
‑
Puro的比例为1:0.8～1.2。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0020]本专利技术的双报告质粒在发生单碱基编辑和同源重组时，报告质粒的荧光会发生变化，从而保证基因编辑载体进入细胞后仍然具有较高的编辑活性，同时由于对同源重组和单碱基编辑(如C变T)均可以进行报告，提高了报告质粒的适用范围。
附图说明
[0021]图1为pCEP4
‑
BFP
‑
T2A
‑
mCherry
‑
GFPHDR
‑
STgRNA表达载体构建流程图；
[0022]图2为pCEP4
‑
BFP
‑
T2A
‑
mCherry
‑
GFPHDR
‑
STgRNA表达载体结构示意图；
[0023]图3为293T细胞转染后加药24h时的荧光发光检测图；
[0024]图4为蓝光到绿光的转变的原理示意图。
具体实施方式
[0025]为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0026]实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]实施例1：靶标位点的选择以及sgRNA的设计
[0028]选择非真核生物基因组上的一段序列作为靶标位点，根据sgRNA靶序列设计原则，构建了1条sgRNA(其靶基因的序列如SEQ ID No.1所示：actcacggggtgcagtgctt)，靶位点碱基长度为20bp，紧邻靶点3
’
端的3个碱基构成PAM区，序列为NGG(N为任意碱基)。
[0029]针对该基因组上序列的sgRNA设计了两条oligo，分别为：ST gRNA
‑
F:CACCGactcacggggtgcagtgctt；ST gRNA
‑
R:AAACaagcactgcaccccgtgagtC。
[0030]实施例2：pCEP4
‑
BFP
‑
T2A
‑
mCherry
‑
GFPHDR
‑
STgRNA表达载体的构建
[0031]pCEP4
‑
BFP
‑
T2A
‑
mCherry
‑
GFPHDR
‑
STgRNA表达载体的构建流程图如图1所示。将蓝
色荧光序列(BFP)、红色荧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒，包括骨架序列和插入序列，其特征在于，所述插入序列依次包括蓝色荧光序列BFP、连接元件T2A、红色荧光序列mCherry、不完整的绿色荧光序列GFPHDR和STgRNA序列。2.根据权利要求1所述的用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒，其特征在于，所述STgRNA的靶基因的序列如SEQ ID No.1所示；所述BFP序列第一部分如SEQ ID No.2所示；所述BFP序列第二部分如SEQ ID No.3所示；所述mCherry序列如SEQ ID No.4所示；所述GFPHDR如SEQ ID No.5所示。3.根据权利要求1所述的用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒，其特征在于，所述骨架序列来自表达载体为pCEP4。4.权利要求1～3任一项所述的用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将骨架表达载体双酶切；(2)分别酶切PCR扩增后的BFP基因、mCherry基因、不完整的GFPHDR基因和靶基因；(3)将步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹庆剑，郑雨龄，唐成程，李万胜，资崯，吴运琴，彭晓华，汪金玲，池玉鹅，金银戈，陈涛，郑伟，周小青，陈敏，赖良学，
申请(专利权)人：五邑大学，
类型：发明
国别省市：