一种可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型及其应用。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在Rosa26基因位点定点插入CAG

【技术实现步骤摘要】
一种可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型及其应用


[0001]本专利技术涉及一种可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]由于细胞核内的微丝数量远少于胞质微丝，经典的鬼笔环肽染色很难区分两者，且鬼笔环肽无法对活细胞的核微丝骨架进行染色。Actin Chromobody是一类可以特异性识别单体肌动蛋白(G
‑
actin)的纳米抗体。有研究者将Actin Chromobody和荧光报告蛋白citrine以及可将重组蛋白转运至细胞核内的核定位序列(Nuclear Localization Signal，NLS)整合成actin
‑
chromobody
‑
citrine
‑1×
NLS(nAC)序列并克隆至慢病毒质粒上，通过慢病毒感染的形式使目的细胞过量表达nAC荧光探针，从而识别细胞核内的单体肌动蛋白和核微丝。此方法相较于鬼笔环肽，可对活细胞进行染色，有助于观察核微丝这一高度动态变化的细胞骨架类型。然而，过往研究发现病毒感染有可能会导致核微丝骨架的形成。通过慢病毒对细胞系进行感染有可能会产生假阳性，从而不利于研究结果的解读。
[0003]在细胞系内过表达可以识别核微丝的探针，这些细胞系无法模拟生理状态下细胞核微丝的存在及表达情况。这些细胞系与生理状态下具备三维结构的原代细胞的形态学有明显的差异，因此在生理状态下可能会存在不同的核微丝形态。此外，一些原代细胞或肿瘤细胞系的探针转染效率非常低，使得对此类细胞核微丝相关的研究陷入困境。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在利用CRISPR/Cas9技术，构建可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型，利用该小鼠模型与Cre工具鼠杂交后得到可在全身组织或特定组织内表达识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠，用于研究核微丝骨架结构在原代细胞生理状况下的功能和核微丝骨架在肿瘤微环境中浸润细胞中的作用。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供了用于构建可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型的组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包括：
[0006]针对小鼠Rosa26位点的gRNA，所述gRNA的序列为GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG；
[0007]包含3.3kb 5
’
同源臂、CAG
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LSL
‑
Actin
‑
Chromobody
‑
Citrine
‑1×
NLS基因片段和3.3kb 3
’
同源臂的同源重组载体；
[0008]针对5
’
同源臂重组鉴定引物及针对3
’
同源臂重组鉴定引物，所述5
’
同源臂重组鉴定引物包括序列为GCCGGGCCTCGTCGTCTG的正向引物和序列为TGAGGGCAATCTGGGAAGGTT的反向引物；所述3
’
同源臂重组鉴定引物包括序列为GGGGGAGGGGAGTGTTGC的正向引物和序列为TTCTTCCTGCCTGCCTTCTGTGAC的反向引物。
[0009]本专利技术还提供了一种可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术构建nAC荧光探针的Rosa26定点敲入小鼠模型，具体如下步骤：
[0010]步骤1：通过体外转录获得Cas9 mRNA和gRNA，通过In
‑
Fusion cloning的方法构建
同源重组载体(donor vector)；基于Cre
‑
LoxP诱导表达系统通过In
‑
Fusion cloning的方法构建同源重组载体，该同源重组载体载体包含3.3kb 5
’
同源臂、CAG
‑
LSL
‑
Actin
‑
Chromobody
‑
Citrine
‑1×
NLS基因片段和3.3kb 3
’
同源臂；所述gRNA的序列为GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG；
[0011]步骤2：显微共注射与F0代小鼠获得：将Cas9 mRNA、gRNA和同源重组载体显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，待小鼠出生后，通过PCR扩增及测序对其进行基因型鉴定，得到F0代嵌合体小鼠；
[0012]步骤3：F1代阳性小鼠获得：将F0代嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代小鼠，通过PCR扩增及测序对其进行基因型鉴定，得到F1代阳性杂合子小鼠Rosa26
LSL/+
，完成可稳定传代小鼠模型的构建。
[0013]本专利技术还提供了一种小鼠模型，所述小鼠模型包括F1代阳性杂合子小鼠模型Rosa26
LSL/+
，F1代阳性小鼠之间经交配繁育得到的F2代杂合子或纯合子小鼠模型，F1代阳性小鼠或F2代阳性小鼠与不同的Cre小鼠品系交配繁育得到的小鼠模型。所述的Cre小鼠品系包括全身细胞表达Cre重组酶的Cre工具小鼠或组织特异性Cre工具小鼠。其中，组织特异性Cre工具小鼠指的是带有组织特异性基因启动子的Cre工具小鼠，特定的Cre工具鼠可以在组织特异性基因启动子调控下表达组织特异性Cre重组酶。
[0014]优选地，所述小鼠模型中具有核微丝结构的细胞或组织可通过荧光检测工具或方法进行识别。
[0015]本专利技术还提供了上述的构建方法构建得到的小鼠模型或上述的小鼠模型在识别具有核微丝骨架结构的组织或细胞中的应用。
[0016]优选地，所述细胞包括黑色素瘤细胞。
[0017]本专利技术还提供了上述的构建方法构建得到的小鼠模型或上述的小鼠模型在不同病理条件下研究细胞核微丝骨架的功能及其作用机制中的应用。
[0018]优选地，包括用于研究核微丝骨架结构在原代细胞生理状况下的功能或核微丝骨架在肿瘤微环境中浸润细胞中的作用。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0020](1)本专利技术利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在Rosa26基因位点定点插入CAG
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LSL
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Actin
‑
Chromobody
‑
Citrine
‑1×
NLS表达框以获得目标小鼠模型；该小鼠模型可在所有细胞中稳定表达可识别核微丝的荧光探针，为研究在生理状态下具有核微丝骨架的细胞类型及其生物学功能奠定了基础。
[0021](2)本专利技术的小鼠模型，可以在生理条件下探索具有细胞核微丝骨架的细胞类型，此外，基于本专利技术的小鼠模型，可根据实验的不同需要，与不同的Cre小鼠交配即可获得在不同组织特异性表达核微丝荧光探针的小鼠，而结合不同的疾病模型小鼠，可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于构建可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型的组合物或试剂盒，其特征在于，所述组合物或试剂盒包括：针对小鼠Rosa26位点的gRNA，所述gRNA的序列为GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG；包含3.3kb 5
’
同源臂、CAG
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LSL
‑
Actin
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Chromobody
‑
Citrine
‑1×
NLS
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WPRE
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polyA基因片段和3.3kb 3
’
同源臂的同源重组载体；针对5
’
同源臂重组鉴定引物及针对3
’
同源臂重组鉴定引物，所述5
’
同源臂重组鉴定引物包括序列为GCCGGGCCTCGTCGTCTG的正向引物和序列为TGAGGGCAATCTGGGAAGGTT的反向引物；所述3
’
同源臂重组鉴定引物包括序列为GGGGGAGGGGAGTGTTGC的正向引物和序列为TTCTTCCTGCCTGCCTTCTGTGAC的反向引物。2.一种可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型的构建方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术构建nAC荧光探针的Rosa26定点敲入小鼠模型，具体包括如下步骤：步骤1：通过体外转录获得Cas9 mRNA和gRNA，通过In
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Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)；基于Cre
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LoxP诱导表达系统通过In
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Fusion cloning的方法构建同源...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑义艳，臧荣余，吴韡，邢晓侠，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：