一种条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法及其应用。该构建方法包括如下步骤：将Yap1

【技术实现步骤摘要】
一种条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，特别涉及一种条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]神经系统是脊椎动物体内调节感觉和运动的重要系统，其再生的过程机制一直是生物学和医学的研究热点。神经系统再生的基础是神经干细胞的增殖和分化。因此构建神经干细胞增殖的动物模型就成这一过程中了亟待解决的关键问题。墨西哥钝口螈是一种再生能力极强的生物，其皮肤、四肢、尾部、心脏甚至脊髓和大脑均可以在损伤后近乎完美的再生
[1]，且目前已经建立了较成熟的人工饲养技术和转基因技术
[2]。
[0003]传统的动物模型根据构建方法分为自发性动物模型和诱发性动物模型两大类。自发性模型是指通过人工选育的手段将动物自发产生了某种性状保留下来。但是动物自发产生的突变具有随机性，而且需要经过多代的遗传选育过程，构建流程较为漫长，但构建出的模型遗传特性稳定，一旦获得可以稳定传代。诱发性动物模型则是通过物理、化学因素诱使动物产生某种疾病或性状用于研究。该方法构建过程较为快速，能短时间获得大量的用于研究的动物模型，但是该方法产生的动物模型并不是可遗传的，研究过程中需要多次制备，由于实验动物不同批次之间的差异，结果往往并不稳定。而基因工程方法通过对实验动物的特定基因靶点进行过表达或者敲除可以在较短时间内(1
‑
2代动物)完成动物模型的构建
[3]，同时产生的性状可以稳定的在后代中遗传，这克服了自发性和诱发性模型的某些缺点。
[0004]Yap1是参与再生过程中的重要基因，皮肤中的Yap1在基底层以及毛囊中的基底干细胞中高表达，随着年龄的上升表达水平逐渐下降，干细胞增殖能力和皮肤更新能力也同时减弱
[4]。在皮肤基底细胞中过度激活Yap1可导致其大量增殖
[5]。肠道上皮再生时，Yap1的表达水平也出现显著上升
[6]。新生小鼠的的心脏仍然保持一定再生能力，特异性敲除心肌细胞中的Yap1会导致新生小鼠心脏再生能力丢失
[7]。激活成年肝细胞中的Yap1的表达，可以诱导其转分化成类似祖细胞的状态
[8]。在小鼠嗅觉上皮敲除Yap1后，其再生及嗅觉恢复被抑制
[9]。上述结果说明，再生过程中过表达Yap1可以诱导细胞进入干细胞状态。这提示我们，通过在体细胞过表达Yap1基因，有望使其转化为干细胞状态。因此，构建一种条件性神经干细胞增殖动物模型，进而实现神经干细胞的可控诱导增殖具有重要现实意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供所述条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法的应用。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法，包括如下步骤：
[0009](1)将Yap1
S96A/S352A
突变体片段连接到经限制性内切酶BmtI和EcoRI酶切后的CAGGs:LP
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EGFP
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LP
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Cherry质粒骨架上，得到CAGGs:LP
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EGFP
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LP
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Yap1
S96AS352A
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T2A
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Cherry质粒；其中，Yap1
S96A/S352A
突变体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0010](2)将CAGGs:LP
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EGFP
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LP
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Yap1
S96AS352A
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T2A
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Cherry质粒和Tol2转座酶mRNA显微注射到墨西哥钝口螈受精卵中，然后室温常规饲养，得到诱导性过表达Yap1突变体的动物；
[0011](3)将Cre重组酶表达质粒CAGGs:ER
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Cre
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ER
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T2A
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EGFP
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nuc电转至诱导性过表达Yap1突变体的动物的脊髓处，继续常规饲养，以诱导Yap1
S96AS352A
突变体过表达(进而诱导神经细胞转分化为神经干细胞并增殖)，得到所述的墨西哥钝口螈动物模型。
[0012]步骤(2)中所述的显微注射为采用本领域的常规注射方式进行；优选为通过如下步骤实现：
[0013]a、收集墨西哥钝口螈的受精卵，依次用纯水、乙醇溶液和纯水清洗，然后用尖头镊子剥去受精卵外膜，将受精卵置于含有质量分数10％聚蔗糖的1
×
MMR溶液中；
[0014]b、将CAGGs:LP
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EGFP
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LP
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Yap1
S96AS352A
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T2A
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Cherry质粒、Tol2转座酶mRNA和无核酸酶水(无DNA酶及RNA酶超纯水)混合均匀，得到显微注射体系；然后将其注射到每个受精卵中，注射后的受精卵转移到含有质量分数10％聚蔗糖的1
×
MMR溶液中，2小时后更换为含有质量分数5％聚蔗糖的0.1
×
MMR溶液中，12～24小时后更换为0.1
×
MMR溶液中，室温培养两周。
[0015]步骤a中所述的乙醇溶液的浓度为体积百分比75％。
[0016]步骤a和b中所述的聚蔗糖优选为聚蔗糖400(Ficoll 400)，其分子量约400000。
[0017]步骤b中所述的显微注射体系中CAGGs:LP
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EGFP
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LP
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Yap1
S96AS352A
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T2A
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Cherry质粒的浓度为10ng/uL；Tol2转座酶mRNA的浓度为50ng/uL。
[0018]步骤(2)中所述的常规饲养为按常规饲养墨西哥钝口螈的方式进行饲养，具体为：室温培养两周后，更换为饲养用水，然后喂食丰年虾至体长2～2.5cm，再进行下一步实验。
[0019]所述的饲养用水为充分通气除氯后的自来水。
[0020]步骤(2)中所述的诱导性过表达Yap1突变体的动物的体长为2～2.5cm。
[0021]步骤(3)中所述的诱导Yap1
S96AS352A
突变体过表达的时间为一周以上。
[0022]步骤(3)中所述的Cre重组酶表达质粒CAGGs:ER
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Cre
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ER
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T2A
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EG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将Yap1
S96A/S352A
突变体片段连接到经限制性内切酶BmtI和EcoRI酶切后的CAGGs:LP
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EGFP
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LP
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Cherry质粒骨架上，得到CAGGs:LP
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EGFP
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LP
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Yap1
S96AS352A
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T2A
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Cherry质粒；其中，Yap1
S96A/S352A
突变体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将CAGGs:LP
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EGFP
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LP
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Yap1
S96AS352A
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T2A
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Cherry质粒和Tol2转座酶mRNA显微注射到墨西哥钝口螈受精卵中，然后室温常规饲养，得到诱导性过表达Yap1突变体的动物；(3)将Cre重组酶表达质粒CAGGs:ER
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Cre
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ER
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T2A
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EGFP
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nuc电转至诱导性过表达Yap1突变体的动物的脊髓处，继续常规饲养，以诱导Yap1
S96AS352A
突变体过表达，得到所述的墨西哥钝口螈动物模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所述的诱导性过表达Yap1突变体的动物的体长为2～2.5cm。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)中所述的诱导Yap1
S96AS352A
突变体过表达的时间为一周以上。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)中所述的Cre重组酶表达质粒CAGGs:ER
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Cre
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ER...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘彦梅，费继锋，阳磊，李响，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：