无帽线性且无修饰尿苷的mRNA技术平台制造技术

本申请公开了一种mRNA

【技术实现步骤摘要】
无帽线性且无修饰尿苷的mRNA技术平台


[0001]本申请涉及mRNA构建
，尤其涉及一种无帽线性且无修饰尿苷的mRNA技术平台的构建方法及应用，所述应用包含用所述无帽线性且无修饰尿苷的mRNA技术平台制备mRNA疫苗或药物。

技术介绍

[0002]mRNA，也叫信使RNA(messenger RNA)，负责传递DNA中储存的遗传信息，指导细胞中蛋白质的合成。理论上，应用mRNA技术将修饰后的mRNA分子送入细胞质，mRNA利用细胞质内的氨基酸进行翻译，可以生成任何所需的蛋白质。然而mRNA具有极不稳定、易引发不必要的免疫反应、易被体内外广泛存在的RNA酶降解、依赖于靶细胞中的翻译机制等特征，数十年来，科学家们为之探索。
[0003]研究发现mRNA存在许多化学修饰，在mRNA的稳定性方面具有生物学意义。目前，普遍应用于mRNA的化学修饰有以下几种：N1
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和N6
‑
甲基腺苷(m1A，m6A，m6Am)、3
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和5
‑
甲基胞嘧啶(m3C，m5C)、5
‑
羟甲基胞嘧啶(hm5C)、2'
‑
O
‑
甲基化(Nm)和假尿苷(Ψ)。
[0004]在上述化学修饰中，m1A上的甲基会阻断Watson
‑
Crick碱基配对，从而改变mRNA结构，促进翻译起始；m6A是可逆的动态RNA修饰，是RNA代谢调控不可或缺的组成部分，可调节mRNA的稳定性，剪接，转运，定位和翻译；5
‑
甲基胞嘧啶(m5C)影响RNA的结构稳定性和翻译效率，可以促进mRNA的核输出；2'
‑
O
‑
甲基化是RNA的共转录或转录后修饰，可以增加RNA的疏水性，保护其免受核酸酶攻击，稳定RNA的螺旋结构，也可影响RNA与蛋白质或其他RNA的相互作用；假尿苷(Ψ)则是首次发现也是含量最丰富的RNA修饰。Katalin Karik
ó
等人相继发现，将假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性随着假尿苷引入比例的增高而降低；用假尿苷完全替代尿苷的mRNA不仅能极大地降低mRNA的免疫原性，还能提高mRNA的稳定性并增强其翻译能力；2015年，Oliwia Andries等人发现用N1
‑
甲基假尿苷完全替代尿苷比用假尿苷完全替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增强mRNA的蛋白表达能力；已上市的两款新型冠状病毒mRNA疫苗mRNA
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1273(Moderna)和BNT162b2(辉瑞
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BioNTech)均使用N1
‑
甲基假尿苷三磷酸(N1mψTP)取代尿苷三磷酸(UTP)。
[0005]从结构上看，真核生物mRNA分子通常含有5'帽子、5'非编码区(5'untranslated region,5'UTR)、编码区、3'非编码区(3'UTR)和3'尾部结构。mRNA的帽子结构使得5'端封闭起来，可避免核酸外切酶水解；还可作为蛋白合成系统的辨认信号，被帽子结合蛋白(cap binding protein，eIF
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4E)识别并结合，促使mRNA与核糖体小亚基结合，启动翻译过程，发挥稳定mRNA和促进翻译的重要作用。通常可采用帽结构类似物，如：m7GpppG共转录加帽或单独使用加帽酶，如：牛痘病毒加帽酶(VCE,Vaccinia caping enzyme)进行转录后加帽。除了用5'帽子来介导核糖体结合、促进翻译，内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site,IRES)也具有与5'帽子相似的功能。1988年，Pelletier等发现脊髓灰质炎病毒的5'UTR有长约450个核苷酸的P2序列可以指导真核mRNA翻译；Jang等也发现脑心肌炎病毒5'UTR中的一段序列能够指导内部核糖体进入，从而起始翻译；1991年，Macejak等发现在细
A片段区，在以往的研究结果中，3'非编码区(3'UTR)具有增强mRNA稳定性的作用，本申请实施例中，所制得的mRNA中，去除了3'非编码区(3'UTR)，在最终的翻译表达过程中，仍然取得了很高的表达量，在此研究基础上，本申请提供的mRNA，结构简单，制备效率高，表达效率高。
[0014]在mRNA递送环节，本申请提供一种全新的脂质纳米颗粒(LNPs)作为mRNA递送载体，所述LNPs递送载体能有效地将mRNA递送到特定的靶细胞，使mRNA避免被降解或清除；同时能及时帮助mRNA从细胞内涵体中逃逸到细胞质中，翻译成相应的目标蛋白。
[0015]基于以上构思，本申请提供一种mRNA
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LNP的构建方法及应用，所述mRNA
‑
LNP是由脂质纳米粒(LNP)包封的信使核糖核酸链(mRNA)。本申请专利技术人以此构建方法和应用技术为基础形成了高效、稳定的无帽线性且无修饰尿苷的mRNA技术平台。
[0016]第一方面，本申请提供一种无帽mRNA，其由a、b、c区域依次连接形成线性结构；所述a、b、c区域分别由腺嘌呤(A)核糖核苷酸、鸟嘌呤(G)核糖核苷酸、胞嘧啶(C)核糖核苷酸、尿嘧啶(U)核糖核苷酸中的至少一种组成；其中，
[0017]a为5'非编码区；其含内部核糖体进入位点序列(IRES)，所述IRES用于介导核糖体亚基的内部进入从而指导所述mRNA进行翻译；
[0018]b为编码区；其用于转录形成蛋白质；
[0019]c为poly A片段区，其用于调节mRNA的翻译效率及增强mRNA的稳定性。
[0020]第二方面，本申请提供了一种重组质粒，用于制备第一方面所述的无帽mRNA，其中所述重组质粒为A～C的任一种：
[0021]A.包含的目的基因为II型单纯疱疹病毒的D型囊膜蛋白胞外域基因gD
ED
，序列如SEQ ID NO：1所示；或与SEQ ID NO：1所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与基因gD
ED
编码蛋白相同活性的蛋白的基因；
[0022]B.包含的目的基因为II型单纯疱疹病毒的D型囊膜蛋白截短基因gD
FR
，序列如SEQ ID NO：2所示；或与SEQ ID NO：2所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与gD
FR
编码蛋白相同活性的蛋白的基因；
[0023]C.包含的目的基因为新型冠状病毒S蛋白Delta毒株突变基因S
δT
，序列如SEQ ID NO：3所示；或与SEQ ID NO：3所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与基因S
δT
编码蛋白相同活性的蛋白的基因。
[0024]第三方面，本申请提供了一种mRNA
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LNP，所述mRNA
‑
LNP为脂质纳米粒包裹信使核糖核酸链，其中所述mRNA...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无帽mRNA，其由a、b、c区域依次连接形成线性结构；所述a、b、c区域分别由腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸中的至少一种组成；其中，a为5'非编码区；其含内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列用于介导核糖体亚基的内部进入从而指导所述mRNA进行翻译；b为编码区；其用于转录形成蛋白质；c为poly A片段区，其用于调节所述mRNA的翻译效率及增强所述mRNA的稳定性。2.根据权利要求1所述的无帽mRNA，其通过重组质粒转录制得，其中所述重组质粒为A～C的任一种：A.包含的目的基因为II型单纯疱疹病毒的D型囊膜蛋白胞外域基因gD
ED
，序列如SEQ ID NO：1所示；或与SEQ ID NO：1所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与基因gD
ED
编码蛋白相同活性的蛋白的基因；B.包含的目的基因为II型单纯疱疹病毒的D型囊膜蛋白截短基因gD
FR
，序列如SEQ ID NO：2所示；或与SEQ ID NO：2所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与基因gD
FR
编码蛋白相同活性的蛋白的基因；C.包含的目的基因为新型冠状病毒S蛋白Delta毒株突变基因S
δT
，序列如SEQ ID NO：3所示；或与SEQ ID NO：2所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与基因S
δT
编码蛋白相同活性的蛋白的基因。3.一种重组质粒，其转录可获得权利要求1所述的无帽mRNA，其中，所述重组质粒为A～C的任一种：A.包含的目的基因为II型单纯疱疹病毒的D型囊膜蛋白胞外域基因gD
ED
，序列如SEQ ID NO：1所示；或与SEQ ID NO：1所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与基因gD
ED
编码蛋白相同活性的蛋白的基因；B.包含的目的基因为II型单纯疱疹病毒的D型囊膜蛋白截短基因gD
FR
，序列如SEQ ID NO：2所示；或与SEQ ID NO：2所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与gD
FR
编码蛋白相同活性的蛋白的基因；C.包含的目的基因为新型冠状病毒S蛋白Delta毒株突变基因S
δT
，序列如SEQ ID NO：3所示；或与SEQ ID NO：3所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与基因S
δT
编码蛋白相同活性的蛋白的基因。4.一种mRNA
‑
LNP，其中所述mRNA
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘滨磊，蔡林康，倪鹏，
申请(专利权)人：武汉滨会生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：