基于CRISPRi和CRISPRa的转录调控系统、其建立方法及应用技术方案

本发明专利技术提供了一种基于CRISPRi和CRISPRa的转录调控系统、其建立方法及应用。本发明专利技术的新型转录调控系统是一种高表达强度、低渗漏水平、灵活可编程的新型转录调控系统。本发明专利技术也揭示了该转录调控系统实现基因高强度低渗漏表达的方法：通过CRISPRi器件和CRISPRa器件对下游信号效应器件的协同调控，在压制本底表达的同时实现高强度转录水平。本发明专利技术所述的新型转录调控系统，通过装载不同输入启动子，可以得到响应特定信号的新型表达系统，对于高效的异源蛋白表达平台和微生物细胞工厂的开发和建立具有应用价值。建立具有应用价值。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPRi和CRISPRa的转录调控系统、其建立方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及一种基于CRISPRi和CRISPRa的转录调控系统、其建立方法及应用。

技术介绍

[0002]基于优质底盘宿主，通过异源表达实现功能蛋白和化学品的高水平、可调控生产，是目前合成生物学和代谢工程领域的研究热点和主要方向之一。
[0003]由启动子介导的基因转录过程是决定基因表达强度和调控模式的关键步骤，一些来源于不同宿主的高效天然启动子被鉴定开发并广泛应用于学术研究和工业生产。然而，随着生物产业的快速发展，受限于有限的优质启动子数量及单一的信号响应模式，天然转录系统已经难以满足本领域中日渐多样化的研究及生产需求。因此，需要通过启动子工程和转录因子工程技术，对天然转录系统进行改造，以期开发出新型调控系统。
[0004]然而，对于天然转录系统的改造不可避免地会与细胞自身调控网络和遗传背景产生相互干扰，使基因转录强度和调控模式难以取得突破性进展。
[0005]因此，本领域有必要开发能够人工定制且高效可控的通用转录系统和蛋白表达平台，以满足日益增长的研究及生产需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPRi和CRISPRa的新型转录调控系统及其应用。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供一种基于CRISPRi和CRISPRa的转录调控系统，包括：信号效应器件，其包括目标启动子以及与之操作性连接的目的基因；CRISPRi阻遏器件，其靶向阻遏所述目标启动子，减弱目标启动子驱动的目的基因的表达；CRISPRa激活器件，其靶向激活所述目标启动子，增强目标启动子驱动的目的基因的表达。
[0008]在一个优选例中，所述CRISPRi阻遏器件包括：表达盒a，其表达基于CRISPR系统的失活Cas蛋白1(CRISPR
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dCas)；及，表达盒b，其表达引导RNA即giRNA，所述giRNA引导所述失活Cas蛋白1至所述信号效应器件中的目标启动子区；所述CRISPRa激活器件包括：表达盒c，其表达基于CRISPR系统的失活Cas蛋白2与转录激活因子的融合多肽；及，表达盒d，其表达引导RNA即gaRNA或craRNA，所述gaRNA或craRNA引导所述失活Cas蛋白2至所述信号效应器件中的目标启动子区；其中，所述失活Cas蛋白1与所述失活Cas蛋白2识别目标启动子序列中不同的PAM序列，相互正交(较佳地，所述“正交”指功能独立，相互之间的元件不发生串扰)；所述giRNA与gaRNA或craRNA能形成giRNA
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gaRNA或giRNA
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craRNA二聚体，相互作用以调控阻遏或激活作用的强弱；较佳地，所述gaRNA或craRNA与所述giRNA的部分序列互补以形成二聚体。
[0009]在另一优选例中，所述giRNA包括区段a和Cas蛋白结合区a，所述区段a与所述信号效应器件中的目标启动子互补；所述gaRNA或craRNA包括区段b和Cas蛋白结合区b；所述区
段b与区段a互补，或所述区段a或b与Cas蛋白结合区a或b互补结合。
[0010]在另一优选例中，所述互补包括基本上互补，如60％、70％、80％、90％、95％或98％的碱基互补。
[0011]在另一优选例中，表达盒a中，包括启动子，其驱动失活Cas蛋白1的表达；较佳地，所述启动子包括：组成型启动子或诱导型启动子；更佳地，所述启动子包括(但不限于)：GAP启动子、ENO1启动子、GPM1启动子、ICL1启动子、AOX2启动子、TEF1启动子、PGK1启动子、GTH1启动子、DAS1启动子、FBA2启动子、THI11启动子、LRA3启动子；较佳地，表达盒a中的启动子不同于信号效应器件中的目标启动子。
[0012]在另一优选例中，表达盒a中，所述失活Cas蛋白1为核酸酶活性缺失的Cas蛋白或其突变体；较佳地，为dCas9；较佳地，所述dCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或其简并的序列。
[0013]在另一优选例中，所述dCas9基因还包括：与SEQ ID NO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列的基因。
[0014]在另一优选例中，表达盒b中，包括启动子，其驱动giRNA的表达；较佳地，所述启动子包括：组成型启动子或诱导型启动子；较佳地，所述组成型启动子包括(但不限于)：GAP启动子、ENO1启动子、GPM1启动子、TEF1启动子、PGK1启动子；较佳地，所述诱导型启动子包括(但不限于)：鼠李糖诱导型启动子、甲醇诱导型启动子、硫胺素饥饿诱导型启动子；更佳地，所述的鼠李糖诱导型启动子包括(但不限于)LRA3启动子，所述的甲醇诱导型启动子包括(但不限于)DAS1启动子、FBA2启动子，或所述的硫胺素饥饿诱导型启动子包括(但不限于)THI11启动子；较佳地，表达盒b中的启动子不同于信号效应器件中的目标启动子。
[0015]在另一优选例中，表达盒b中，所述的giRNA引导表达盒a中失活Cas蛋白1至所述信号效应器件中的目标启动子区。
[0016]在另一优选例中，表达盒c中，包括启动子，其驱动失活Cas蛋白2与转录激活因子的融合多肽的表达；较佳地，所述启动子包括：组成型启动子或诱导型启动子；更佳地，所述启动子包括(但不限于)：GAP启动子、ENO1启动子、GPM1启动子、ICL1启动子、AOX2启动子、TEF1启动子、PGK1启动子、GTH1启动子、DAS1启动子、FBA2启动子、THI11启动子、LRA3启动子；较佳地，表达盒c中的启动子不同于信号效应器件中的目标启动子。
[0017]在另一优选例中，表达盒c中，所述失活Cas蛋白2为核酸酶活性缺失的Cas蛋白或其突变体；较佳地，包括VRER或dCpf1；较佳地，所述的VRER基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示或其简并的序列，所述的dCpf1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示或其简并的序列。
[0018]在另一优选例中，所述VRER基因还包括：与SEQ ID NO:7序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列的基因；
[0019]在另一优选例中，所述dCpf1基因还包括：与SEQ ID NO:8序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列的基因。
[0020]在另一优选例中，表达盒d中，包括启动子，其驱动gaRNA或craRNA的表达；较佳地，
所述启动子包括：组成型启动子或诱导型启动子；较佳地，所述组成型启动子包括(但不限于)：GAP启动子、ENO1启动子、GPM1启动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPRi和CRISPRa的转录调控系统，包括：信号效应器件，其包括目标启动子以及与之操作性连接的目的基因；CRISPRi阻遏器件，其靶向阻遏所述目标启动子，减弱目标启动子驱动的目的基因的表达；CRISPRa激活器件，其靶向激活所述目标启动子，增强目标启动子驱动的目的基因的表达。2.如权利要求1所述的转录调控系统，其特征在于，所述CRISPRi阻遏器件包括：表达盒a，其表达基于CRISPR系统的失活Cas蛋白1；及，表达盒b，其表达引导RNA即giRNA，所述giRNA引导所述失活Cas蛋白1至所述信号效应器件中的目标启动子区；所述CRISPRa激活器件包括：表达盒c，其表达基于CRISPR系统的失活Cas蛋白2与转录激活因子的融合多肽；及，表达盒d，其表达引导RNA即gaRNA或craRNA，所述gaRNA或craRNA引导所述失活Cas蛋白2至所述信号效应器件中的目标启动子区；其中，所述失活Cas蛋白1与所述失活Cas蛋白2识别目标启动子序列中不同的PAM序列，相互正交；所述giRNA与gaRNA或craRNA能形成giRNA
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gaRNA或giRNA
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craRNA二聚体，相互作用以调控阻遏或激活作用的强弱；较佳地，所述gaRNA或craRNA与所述giRNA的部分序列互补以形成二聚体。3.如权利要求2所述的转录调控系统，其特征在于，所述giRNA包括区段a和Cas蛋白结合区a，所述区段a与所述信号效应器件中的目标启动子互补；所述gaRNA或craRNA包括区段b和Cas蛋白结合区b；所述区段b与区段a互补，或所述区段a或b与Cas蛋白结合区a或b互补结合。4.如权利要求2所述的转录调控系统，其特征在于，表达盒a中，包括启动子，其驱动失活Cas蛋白1的表达；较佳地，所述启动子包括：组成型启动子或诱导型启动子；更佳地，所述启动子包括：GAP启动子、ENO1启动子、GPM1启动子、ICL1启动子、AOX2启动子、TEF1启动子、PGK1启动子、GTH1启动子、DAS1启动子、FBA2启动子、THI11启动子、LRA3启动子；较佳地，表达盒a中的启动子不同于信号效应器件中的目标启动子；和/或表达盒a中，所述失活Cas蛋白1为核酸酶活性缺失的Cas蛋白或其突变体；较佳地，为dCas9；较佳地，所述dCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或其简并的序列。5.如权利要求2所述的转录调控系统，其特征在于，表达盒b中，包括启动子，其驱动giRNA的表达；较佳地，所述启动子包括：组成型启动子或诱导型启动子；较佳地，所述组成型启动子包括：GAP启动子、ENO1启动子、GPM1启动子、TEF1启动子、PGK1启动子；较佳地，所述诱导型启动子包括：鼠李糖诱导型启动子、甲醇诱导型启动子、硫胺素饥饿诱导型启动子；更佳地，所述的鼠李糖诱导型启动子包括LRA3启动子，所述的甲醇诱导型启动子包括DAS1启动子、FBA2启动子，或所述的硫胺素饥饿诱导型启动子包括THI11启动子；较佳地，表达盒b中的启动子不同于信号效应器件中的目标启动子；和/或表达盒b中，所述的giRNA引导表达盒a中失活Cas蛋白1至所述信号效应器件中的目标启动子区。6.如权利要求2所述的转录调控系统，其特征在于，表达盒c中，包括启动子，其驱动失活Cas蛋白2与转录激活因子的融合多肽的表达；较佳地，所述启动子包括：组成型启动子或诱导型启动子；更佳地，所述启动子包括：GAP启动子、ENO1启动子、GPM1启动子、ICL1启动
子、AOX2启动子、TEF1启动子、PGK1启动子、GTH1启动子、DAS1启动子、FBA2启动子、THI11启动子、LRA3启动子；较佳地，表达盒c中的启动子不同于信号效应器件中的目标启动子；和/或表达盒c中，所述失活Cas蛋白2为核酸酶活性缺失的Cas蛋白或其突变体；较佳地，包括VRER或dCpf1；较佳地，所述的VRER基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示或其简并的序列，所述的dCpf1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示或其简并的序列。7.如权利要求2所述的转录调控系统，其特征在于，表达盒d中，包括启动子，其驱动gaRNA或craRNA的表达；较佳地，所述启动子包括：组成型启动子或诱导型启动子；较佳地，所述组成型启动子包括：GAP启动子、ENO1启动子、GPM1启动子、TEF1启动子、PGK1启动子；较佳地，所述诱导型启动子包括：鼠李糖诱导型启动子、甲醇诱导型启动子、硫胺素饥饿诱导型启动子；更佳地，所述的鼠李糖诱导型启动子包括LRA3启动子，所述的甲醇诱导型启动子包括DAS1启动子、FBA2启动子，或所述的硫胺素饥饿诱导型启动子包括THI11启动子；较佳地，表达盒d中的启动子不同于信号效应器件中的目标启动子；和/或表达盒d中，所述的gaRNA或craRNA引导表达盒c中失活Cas蛋白2至所述信号效应器件中的目标启动子区。8.如权利要求2或6所述的转录调控系统，其特征在于，所述转录激...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡孟浩，刘启，张元兴，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：