一种利用鱼腥藻内含子自剪切核酶精准制备环状RNA的方法技术

本发明专利技术属于核酸技术领域，具体涉及一种利用鱼腥藻内含子自剪切核酶精准制备环状RNA的方法。通过对目标线性RNA核酸序列进行再设计，选择适合内含子自剪切核酶进行精准剪切的位点，并对鱼腥藻内含子自剪切核酶中外显子序列的去除，实现了RNA体外转录精准环化。本发明专利技术提供的方法解决了现有技术中线性RNA在体外生成环状RNA过程中不能精准环化的问题，为环状RNA应用提供一种理想的体外制备方法。应用提供一种理想的体外制备方法。应用提供一种理想的体外制备方法。

【技术实现步骤摘要】
一种利用鱼腥藻内含子自剪切核酶精准制备环状RNA的方法


[0001]本专利技术属于核酸
，具体涉及一种利用鱼腥藻内含子自剪切核酶精准制备环状RNA的方法。

技术介绍

[0002]高通量测序技术及生物信息学分析方法的进步使研究者在众多生物体中发现了大量客观存在的环状RNA分子，环状RNA和多种疾病的发生发展有密切的关系。早些年的研究报道认为环状RNA是一种非编码蛋白的RNA分子，通过和miRNA互作，充当海绵作用，起到调控基因表达的作用；随着研究的深入发现环状RNA可以通过多种途径发挥作用。环状RNA可通过和基因组DNA互作调控基因的转录过程，还可以与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性，另外环状RNA也可作为翻译的模板直接翻译成功能性多肽或蛋白质。
[0003]近年来mRNA作为蛋白替代疗法被广泛应用。通过在编码蛋白的核酸上下游人工设计添加5
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UTR和3
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UTR及多聚腺苷酸序列体外组装成治疗性的mRNA可以在体内高效生成目标蛋白，从而实现对一些遗传疾病进行基因治疗；经过核酸修饰的人工mRNA可以在体内高效生成抗原性蛋白，使得mRNA可以应用于多种传染性疾病的疫苗开发。线性mRNA具有暴露的5＇和3＇端序列使其在体外及体内很不稳定，半衰期较短，这大大限制了mRNA的应用。环状RNA不具有5＇末端和3末端，使其能够耐受RNA酶降解，比线性的mRNA分子稳定性强，经过人工设计的环状RNA不需要特殊核酸修饰即可实现在细胞内高效翻译目标多肽或者蛋白，且相对于线性mRNA分子，环状RNA具有较低的宿主免疫副作用。
[0004]目前常用体外转录制备环状RNA的方法主要是通过先体外生成线性RNA，然后通过酶法连接环化、内含子自剪切核酶切割连接环化。使用T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶1和T4 RNA连接酶2等酶法环化线性RNA能实现RNA的有效环化，此类方法需要使用额外的夹板或者人工选择内部二级结构作为辅助才能实现有效环化，但本方法对使用者技术要求较高。传统内含子自剪切方法制备的环状RNA，需要在目标分子两侧各添加一段外显子序列才能使目标分子环化，添加的外显子序列会引入到目标环状RNA序列中，最终目标环状RNA中会多出来大段的无用序列。有研究者报道通过人工设计选择目标分子的起始及末端碱基序列，通过T4噬菌体内含子自剪切系统来精准制备环状RNA(Nucleic Acids Research,2021,Vol.49,No.6e35)，但此方法制备效率较低，很难达到规模化工业制备的要求。因此，需要建立起一种操作简单、精准制备环状RNA的方法。
[0005]中国专利CN111321143A公开了一种制备环状RNA的方法，这种方法可以降低后续纯化工艺的难度；使成环过程当中大分子副产物的产生被显著抑制，但是这种方法在模拟线性RNA二级结构、设计断开位点及后续的连接过程中，均可能出错，降低了形成的环状RNA的准确度。
[0006]中国专利申请CN101679962A公开了一种单链环状RNA及制备该单链环状RNA的方法，这种环状RNA制备方法仅适用于制备很短的小干扰siRNA,不适合制备片段较大的环状
RNA，且必须同时含有有义链序列与反义链序列(二者可以配对形成枝干)，成环序列等。由此可知，这种方法适用范围低，且无法实现较大片段环状RNA的规模化制备。
[0007]综上可知，现有的制备环状RNA方法普遍具有效率低、制备过程复杂、精确度达不到要求等问题。

技术实现思路

[0008]针对现有技术普遍存在的缺陷，本专利技术提供了一种利用鱼腥藻内含子自剪切核酶精准制备环状RNA的方法。通过对目标分子进行序列选择设计，并对鱼腥藻内含子自剪切核酶中外显子序列的去除，实现了RNA体外转录精准环化，为环状RNA应用提供一种理想的体外制备方法。
[0009]本专利技术采用的具体技术方案如下：
[0010]一种利用鱼腥藻内含子自剪切核酶精准制备环状RNA的方法，包括如下步骤：
[0011]S1、利用核酸二级结构分析软件RNAfold对鱼腥藻内含子自剪切核酶的二级结构进行分析，筛选出上、下游外显子中与自剪切核酶活性密切相关的序列；
[0012]S2、选择一条同时含有步骤S1筛选出来的序列的人工序列，将鱼腥藻原来的上游内含子和下游内含子序列倒转，然后将人工序列替换掉鱼腥藻内含子自剪切核酶中原有的外显子序列，形成精准制备环状RNA的鱼腥藻内含子自剪切框架；
[0013]S3、在步骤S2获得的鱼腥藻内含子自剪切框架序列的上、下游各加入一段18个碱基的反向互补序列，然后在序列两侧添加T7转录启动子及两端添加限制性内切酶位点，构成线性RNA总序列，导入pUC19骨架载体中，制成质粒；
[0014]S4、使用内切酶EcoRI酶切步骤S3获得的质粒，获得线性化质粒，进一步纯化，并经体外转录、DNA模板消化过程获得转录线性RNA，再一次纯化，获得纯化后的转录线性RNA；
[0015]S5、将步骤S4获得的纯化后的转录线性RNA体外环化，经纯化，获得纯化的环化RNA，并进一步进行耐受性检测、环状RNA环化接口验证，即得。
[0016]优选地，步骤S1所述鱼腥藻内含子自剪切核酶序列在GenBank数据库收录登陆号为GenBank:AY768517，具体序列信息如SEQ ID NO.1所示；上游外显子中与自剪切核酶活性密切相关的序列为末端序列CUU，下游外显子中与自剪切核酶活性密切相关的序列为起始碱基A。
[0017]5‘
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(SEQ ID N0.1)；
[0018]优选地，步骤S2所述的人工序列如SEQ ID NO.2所示；制成的鱼腥藻内含子自剪切框架序列信息如SEQ ID NO.3所示。
[0019]AUUAAUCAUCAUCCUAGCCCUAAGUCUGGCCUAUGAGUGACUACAACUCAACGGCUACAUAGAAAAAUCCACCCCUUACGAGUGCGGCUUCGACCCUAUAUCCCCCGCCCGCGUCCCUUUCUCCAUAAAAUUCUUCUUAGUAGCUAUUACCUUCUUAUUAUUUGAUCUAGAAAUUGCCCU本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用鱼腥藻内含子自剪切核酶精准制备环状RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、利用核酸二级结构分析软件RNAfold对鱼腥藻内含子自剪切核酶的二级结构进行分析，筛选出上、下游外显子中与自剪切核酶活性密切相关的序列；S2、选择一条同时含有步骤S1筛选出来的序列的人工序列，将鱼腥藻原来的上游内含子和下游内含子序列倒转，然后将人工序列替换掉鱼腥藻内含子自剪切核酶中原有的外显子序列，形成精准制备环状RNA的鱼腥藻内含子自剪切框架；S3、在步骤S2获得的鱼腥藻内含子自剪切框架序列的上、下游各加入一段18个碱基的反向互补序列，然后在序列两侧添加T7转录启动子及两端添加限制性内切酶位点，构成线性RNA总序列，将总序列导入pUC19骨架载体中，制成质粒；S4、使用内切酶EcoRI酶切步骤S3获得的质粒，获得线性化质粒，进一步纯化，并经体外转录、DNA模板消化过程获得转录线性RNA，再一次纯化，获得纯化后的转录线性RNA；S5、将步骤S4获得的纯化后的转录线性RNA体外环化，经纯化，获得纯化的环化RNA，并进一步进行耐受性检测、环状RNA环化接口验证，即得。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述鱼腥藻内含子自剪切核酶序列在GenBank数据库收录登陆号为GenBank:AY768517，具体序列信息如SEQ ID NO.1所示；上游外显子中与自剪切核酶活性密切相关的序列为末端序列CUU，下游外显子中与自剪切核酶活性密切相关的序列为起始碱基A。3.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明，张茂雷，王业胜，蔡秋杰，张婉君，马晓丹，
申请(专利权)人：广州吉赛生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：