防治番茄黄化曲叶病毒病的突变型质粒组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了防治番茄黄化曲叶病毒病的突变型质粒组合及其应用，属于植物病毒学和分子生物学技术领域。本发明专利技术的突变型质粒组合包括pCC

【技术实现步骤摘要】
防治番茄黄化曲叶病毒病的突变型质粒组合及其应用


[0001]本专利技术涉及植物病毒学和分子生物学
，具体涉及防治番茄黄化曲叶病毒病的突变型质粒组合及其应用。

技术介绍

[0002]植物病毒病素有植物“癌症”之称，是农作物的重要病害之一。每年给世界各地的农作物生产造成严重的损失，全世界每年因病毒病为害造成的直接损失达300亿美元以上，防治病毒病一直是农业生产中的世界难题。
[0003]基于弱毒株系的交叉保护是比较有效的防治措施。交叉保护指受一种病毒的弱毒株系侵染的植物可以免受随后同一病毒的强毒株系的侵染。关于交叉保护机制目前业界普遍认可的有“基因沉默
‑
RNAInterference”，“超侵染排阻
‑
super infection exclusion”。“基因沉默
‑
RNA Interference”指病毒复制过程中产生的双链RNA(dsRNA)被Dicer
‑
like(DCL)酶识别并切割成siRNAs，随后这些siRNAs与植物体内的AGO蛋白等物质结合形成RNA诱导沉默复合体(RISC)，该复合体以siRNA其中1条链为指导，特异性的降解和其同源的mRNA，从而达到沉默相关基因的目的。“超侵染排阻
‑
super infection exclusion”指在双重感染的植物组织中，常见到同一病毒的菌株之间的空间分离。这种机制对于交叉保护具有重要意义。
[0004]早在上世纪中叶就有用交叉保护防治植物病毒病的案例。近几年随着分子生物学技术的迅猛发展，人们对交叉保护机制的了解愈发深入，应用交叉保护技术防治植物病毒病逐渐成为一种主流的病毒病害防治方法。
[0005]例如，用RNA病毒弱毒防治RNA病毒的交叉保护：(1)20世纪中叶柑橘衰退病毒(CTV)在巴西广泛传播，Grant和Costa(1951)第一个分离到温和CTV株系，到20世纪末，巴西利用温和株系进行交叉保护的甜橙树就有8000万株。(2)1991年Lecoq和他的同事描述了一种温和的西葫芦黄花叶病毒株系(ZYMV
‑
WK)，在法国的田间条件下将其用于西葫芦的交叉保护，与随后感染严重ZYMV株系的未保护对照植物相比，受保护植物产生了更高的适销果产量。还有大量的RNA病毒被RNA弱毒疫苗防治，如番茄花叶病毒(ToMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、烟草花叶病毒(TMV)
……
[0006]用DNA病毒弱毒防治DNA病毒的交叉保护：(1)先接种辣椒金花叶病毒(PepGMV)24dpi后再接种相同的病毒的恢复植株在新生组织中没有表现出任何症状(Carrillo
‑
Tripp etal.,2006)。(2)非洲木薯花叶病毒(ACMV)DNA
‑
A诱导了对非洲木薯花叶病毒(ACMV)和东非木薯花叶病喀麦隆病毒(EACMCV)的抗性，这种抗性能够使植物从EACMCV引起的严重症状中恢复过来(Fondong et al.,2020)。相关研究有限，且目前还处于实验室研究阶段。
[0007]目前，RNA病毒弱毒疫苗防治RNA病毒病十分普遍，而DNA病毒弱毒防治DNA病毒的应用案例较少，而以RNA病毒弱毒疫苗防治DNA病毒目前还未见有报道。
[0008]番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)属于双生病毒科
(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，是一类具有孪生颗粒形态的植物DNA病毒。TYLCV具有多样化的寄主范围，已在16科49种植物中检测到。TYLCV侵染番茄后表现为植株矮化，叶片上卷、黄化，产量降低，苗期感染时可造成绝收。
[0009]对于番茄黄化曲叶病毒的交叉保护作用，叶剑等发现：与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10分离物(Y10)伴随的卫星DNAβ分子的βC1基因缺失突变体能介导同源或异源DNAβ的交叉保护作用(“与中国番茄黄化曲叶病毒伴随的DNAβ分子βC1缺失突变体介导的交叉保护作用初步研究”，浙江大学学报(农业与生命科学版)，2006年)。但由于不同病毒的DNAβ分子的核苷酸序列同源性较低，对异源野生型DNAβ的保护效果远不如对同源DNAβ的保护。

技术实现思路

[0010]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供防治番茄黄化曲叶病毒病的突变型质粒组合及其应用。本专利技术以黄瓜花叶病毒的RNA2突变型质粒作为载体，在其多克隆位点(MCS)内分别插入番茄黄化曲叶病毒的不同编码框片段，得到突变型质粒组合。将本专利技术的突变型质粒组合与野生型CMVRNA1和RNA3混合后预先接种，对TYLCV侵染具有防治效果；而且，CMV RNA2突变型质粒的骨架结构稳定，使用安全性高，为田间防治由TYLCV引起的植物病害提供了疫苗材料和有效的防治措施。
[0011]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0012]本专利技术的第一方面，提供防治番茄黄化曲叶病毒病的突变型质粒组合，包括如下至少一个突变型质粒：
[0013](1)pCC
F
R2
‑
2bPTI
‑
TYC1C4
‑
1，其含有CMV
Fny
分离物的突变型RNA2，所述突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0014](2)pCC
F
R2
‑
2bPTI
‑
TYC1C4
‑
2，其含有CMV
Fny
分离物的突变型RNA2，所述突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0015](3)pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYV1V2，其含有CMV
Fny
分离物的突变型RNA2，所述突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0016](4)pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYC1C2，其含有CMV
Fny
分离物的突变型RNA2，所述突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0017](5)pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYC1C4
‑
1，其含有CMV
Fny
分离物的突变型RNA2，所述突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0018](6)pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYC1C4
‑
2，其含有CMV
Fny
分离物的突变型RNA2，所述突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.防治番茄黄化曲叶病毒病的突变型质粒组合，包括pCC
F
R2
‑
2bPTI
‑
TYC1C4
‑
1、pCC
F
R2
‑
2bPTI
‑
TYC1C4
‑
2、pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYV1V2、pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYC1C2、pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYC1C4
‑
1、pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYC1C4
‑
2、pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYC2C3
‑
1、pCC
F
R2
‑
2bPTII
‑
TYC2C3
‑
2、pCC
F
R2
‑
2bPTIII
‑
TYRep、pCC
F
R2
‑
2bPTIII
‑
TYR
‑
Rep中的至少一个突变型质粒；所述突变型质粒均含有CMV
Fny
分离物的突变型RNA2，所述突变型RNA2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.10所示。2.根据权利要求1所述的突变型质粒组合，其特征在于，所述突变型质粒组合为如下(1)
‑
(3)任意所示：(1)突变型质粒pCC
F
R2
‑
2bPT
Ⅲ‑
TYRep和pCC
F
R2
‑
2b...

【专利技术属性】
技术研发人员：原雪峰，朱明靖，王昭，刘珊珊，于成明，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：