一种D-对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种D

【技术实现步骤摘要】
一种D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及一种D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用，属于微生物


技术介绍

[0002]D
‑
对羟基苯甘氨酸是一种重要的药物和食品添加剂，在半合成抗生素，多肽，激素，拟除虫菊脂，杀虫剂，甜味剂等的工业生产方面有广泛的应用，主要用于半合成羟氨苄青霉素、头孢羟氨苄和头孢哌酮等抗生素，D
‑
对羟基苯甘氨酸是目前需求量最大的D
‑
型氨基酸，其产量每年在世界范围内达上千吨。
[0003]D
‑
对羟基苯甘氨酸的制备方法主要分为化学合成法和海因酶转化法，目前，化学合成法是D
‑
对羟基苯甘氨酸的主要生产方法，主要包括:不对称转化法，诱导结晶法以及化学拆分法。虽然目前合成D
‑
对羟基苯甘氨酸的化学法较多，但是这些方法在不同程度上都存在反应条件苛刻、环境污染大、生产效率低以及生产成本高的问题。因此，越来越多的研究人员寻求利用酶转化法来合成D
‑
对羟基苯甘氨酸。目前的酶转化法主要是海因酶法:以D,L对羟基苯海因(D,LHPH)为底物，在D
‑
海因酶(D
‑
hydantoinase,DHase)和D
‑
氨甲酰水解酶(D
‑
carbamoylase,DCase)催化下，经中间物N
‑
氨甲酰基D
‑
对羟基苯甘氨酸(D
‑
CpHPG)，生成光学纯的D
‑
HPG的反应,被称为生产D
‑
HPG的海因酶法。
[0004]然而，在海因酶法生产过程中，D
‑
氨甲酰水解酶由于表达量和稳定性等问题制约着其工业化生产。因此，也有用生物转化法来生产D
‑
对羟基苯甘氨酸的，目前生物转化法主要包括大肠杆菌转化和枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌并不能解决N
‑
氨甲酰水解酶的表达量低、稳定性以及其可溶性表达的问题，且因其为革兰氏阳性菌，厚的细胞壁也成为其在催化过程中的限制性因素之一，而现有用于D
‑
对羟基苯甘氨酸生产的大肠杆菌在表达N
‑
氨甲酰水解酶时表达量低，导致D
‑
对羟基苯甘氨酸的产量无法进一步提升。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种表达了D
‑
海因酶(GsDH)和D
‑
氨甲酰水解酶突变体(AkDC
A273T
)的重组大肠杆菌，能够实现提高D
‑
对羟基苯甘氨酸产量的目的。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株，所述的菌株是以质粒pETduet
‑
1为载体，在大肠杆菌宿主中表达D
‑
海因酶(GsDH)和D
‑
氨甲酰水解酶突变体(AkDC
A273T
)。
[0007]进一步地，所述的D
‑
氨甲酰水解酶突变体和D
‑
海因酶均以T7启动子启动表达，其中，D
‑
氨甲酰水解酶突变体构建在第一个启动子之后，D
‑
海因酶构建在第二个启动子之后。
[0008]进一步地，以质粒pETduet
‑
1为载体构建的重组质粒的序列如SEQ ID NO.7所示。
[0009]本专利技术的D
‑
海因酶(GsDH)来源于Geobacillus stearothermophilus，本专利技术的D
‑
氨甲酰水解酶(AkDC)来源于Agrobacterium sp.(strain KNK712)。
[0010]进一步地，所述的D
‑
海因酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]进一步地，所述的D
‑
氨甲酰水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]进一步地，所述的D
‑
氨甲酰水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0013]进一步地，所述的大肠杆菌宿主为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供所述的D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0015](1)获得编码D
‑
氨甲酰水解酶突变体和D
‑
海因酶的基因片段(AkDC
A273T
和GsDH)；
[0016](2)将编码D
‑
氨甲酰水解酶基因片段(AkDC
A273T
)连接到pETduet
‑
1载体上,其中，D
‑
氨甲酰水解酶基因片段(AkDC
A273T
)位于酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间。所得到的重组质粒为pETduet
‑1‑
AkDC
A273T
；
[0017](3)将步骤(2)所述重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，培养并提取质粒，以验证与富集重组质粒pETduet
‑1‑
AkDC
A273T
；
[0018](4)将编码D
‑
海因酶的基因片段(GsDH)连接到步骤(3)所述的重组质粒pETduet
‑1‑
AkDC
A273T
上，其中，D
‑
海因酶的基因片段(GsDH)位于酶切位点XhoⅠ处。所得到的重组质粒为pETduet
‑1‑
AkDC
A273T
‑
GsDH；
[0019](5)将步骤(4)所得的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，得到所述的D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株。
[0020]进一步地，重组质粒pETduet
‑1‑
AkDC
A273T
‑
GsDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0021]本专利技术的第三个目的是提供所述的D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株在生产D
‑
对羟基苯甘氨酸中的应用。
[0022]进一步地，所述的应用是将D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株发酵后的全细胞作为催化剂，催化DL
‑
对羟基苯甘氨酸生成D
‑
对羟基苯甘氨酸。
[0023]进一步地，D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株发酵是将D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株接种至种子液培养基中培养得到种子液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株，其特征在于，所述的菌株是以质粒pETduet
‑
1为载体，在大肠杆菌宿主中表达D
‑
海因酶和D
‑
氨甲酰水解酶突变体。2.根据权利要求1所述的D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株，其特征在于，所述的D
‑
海因酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株，其特征在于，所述的D
‑
氨甲酰水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。4.根据权利要求1所述的D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株，其特征在于，所述的大肠杆菌宿主为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。5.一种权利要求1～4任一项所述的D
‑
对羟基苯甘氨酸高产菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获得编码D
‑
氨甲酰水解酶突变体和D
‑
海因酶的基因片段；(2)将编码D
‑
氨甲酰水解酶突变体基因片段连接到pETduet
‑
1载体上，其中，D
‑
氨甲酰水解酶突变体基因片段位于酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间，所得到的重组质粒为pETduet
‑1‑
AkDC
A273T
；(3)将步骤(2)所述重组质粒导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，培养并提取质粒，以验证与富集重组质粒pETduet
‑1‑
AkDC
A...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，张岚东，刘佳，宋伟，陈修来，高聪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：