一种光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株及筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株及筛选方法和应用，属于生物工程技术领域。该工程菌株包括两个单元：突变

【技术实现步骤摘要】
一种光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株及筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株及筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]光遗传学(optogenetics)是一门结合光和遗传工程操控目标基因的学科，通过将受到光响应的目标蛋白在目标宿主中表达，从而能够通过光刺激调控宿主的生理功能或行为。与光遗传学关联的技术在科学研究与生产制造中获得广泛应用。
[0003]定向进化是模拟达尔文的进化过程，通过人为引入大量突变，按照特定需求和目标筛选获得期望的蛋白质，是一种近年发展起来的蛋白质工程方法，在代谢工程和合成生物学领域发挥着重要作用。定向进化的常见策略包含随机进化、改组技术、半理性进化和理性进化，这些策略的关键点都在于突变的筛选。因此在定向进化的筛选过程中，如何引入大量突变并筛选出符合预期的突变成为了关键所在。
[0004]现有的定向进化的筛选方法多种多样，如包含建库
‑
筛选的循环过程，如专利CN109943581A提供了一种质粒和噬菌体辅助的定向进化筛选系统和方法；专利CN111269822A公开了一种多功能高通量定向进化系统及方法；专利CN211227159U公开了一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，把重复步骤单元化集中到芯片上，增加自动化水平，减少人工操作失误。可以看出，现有用于进化筛选的技术通常需要多通道、多腔室、多单元连续进行以实现筛选，整套装置和方法所需要的装置、通道、连接器件多而复杂。
[0005]当前，光遗传学与定向筛选结合的相关技术较少被报告。

技术实现思路

[0006]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株及筛选方法和应用，以拓宽定向进化筛选方法的策略，提供易于改造和操作简单的定向筛选工程菌株和筛选方法。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0008]本专利技术公开了一种光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株，该工程菌株包括两个单元：
[0009]突变
‑
报告单元，用于引入启动子目标蛋白区域的点突变以及改变目标蛋白的荧光特性或改变目标蛋白调控的下游报告蛋白的荧光特性；
[0010]致死
‑
筛选单元，用于为光响应合成抗生素保护目标细菌，同时光响应产生活性氧杀死非目标细菌。
[0011]突变
‑
报告单元中的目标蛋白如果没有荧光，可以由目标蛋白引起的下游荧光报告蛋白作为报告系统。
[0012]优选地，所述突变
‑
报告单元选择一个质粒表达，致死筛选单元选择一个质粒表
达，构成能够同时表达的双质粒表达系统。
[0013]进一步优选地，所述突变
‑
报告单元选择质粒pJN105表达。
[0014]更进一步优选地，所述质粒pJN105上载有阿拉伯糖启动子，为表达T7聚合酶RNAP融合的突变蛋白AID732。
[0015]优选地，在突变
‑
报告单元中，与表达T7聚合酶RNAP融合的突变蛋白AID732可用任一单碱基突变蛋白替代，或者由多种单碱基突变蛋白同时表达替代。
[0016]优选地，所述致死筛选单元选择质粒pSUPAR表达。
[0017]进一步优选地，所述质粒pSUPAR上表达有能够通过蓝光响应筛选在抗生素下存活的目标细菌的蓝光响应蛋白，同时还表达有能够通过红光诱导产生活性氧杀死非目标细菌的红光响应蛋白。
[0018]更进一步优选地，蓝光响应蛋白选择YF1
‑
FixJ双蛋白系统；红光响应蛋白选择KillerRed蛋白。
[0019]优选地，蓝光响应蛋白YF1
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FixJ系统可由任一光响应诱导转录表达系统替代。
[0020]进一步优选地，红光诱导产生活性氧的KillerRed蛋白可由任一光响应产生活性氧的蛋白替代或者光诱导表达致死基因等其他光诱导体系替代。
[0021]更进一步优选地，上述蓝光
‑
红光响应系统响应不同波长的光均可替换。
[0022]更进一步优选地，上述的双质粒表达系统(质粒pSUPAR和质粒pJN105)可以任意两个可同时表达的质粒系统替换。
[0023]本专利技术还公开了上述的光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株的连续进化筛选方法，包括以下步骤：
[0024]S1：单层平铺工程菌株，采用普通培养基进行培养，加入诱导剂诱导融合的突变蛋白表达；
[0025]S2：通过显微成像识别目标菌株和非目标菌株的分布情况；
[0026]S3：针对分布情况，对目标菌株施加蓝光光照并在培养基中加入抗生素，使目标细菌存活而使非目标细菌死亡；同时对非目标菌株施加红光光照，诱导非目标细菌中的致死蛋白产生活性氧而杀死非目标细菌；
[0027]S4：对存活的目标细菌重复S1～S3的操作进行下一轮筛选，直至筛选获得目标细菌。
[0028]优选地，诱导剂采用化学诱导剂或者光诱导剂。
[0029]进一步优选地，诱导剂可以用任意一种化学诱导剂或者光诱导剂替换。
[0030]本专利技术还公开了上述的光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株在定向进化筛选中的应用。
[0031]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0032]本专利技术公开的光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株，包括突变单元、报告单元和致死筛选单元，突变单元是为了引入启动子下游目标蛋白区域的大量点突变，报告单元能够改变目标蛋白或者目标蛋白调控的下游报告蛋白的荧光特性，致死筛选单元为双致死设计，能够完成双响应，其一为光响应合成抗生素保护目标细菌，其二为光响应产生活性氧杀死非目标细菌。该工程菌株的结构设计合理，通过突变诱导、致死筛选能够满足定向进化的筛选设计要求，因而能够解决生物学中大量彼此独立(高通量)的光遗传学测试的问题，
其整体结构简单，适用性广，实际操作方便，对提升高通量光遗传学基因线路的开发效率以及研究光敏基因的基本原理有着重大意义。
附图说明
[0033]图1为专利技术的工程菌株的突变
‑
报告单元示意图；
[0034]图2为本专利技术的工程菌株致死
‑
筛选单元示意图；
[0035]图3为本专利技术的基于光遗传学辅助的连续定向进化筛选方法流程图；
[0036]图4为工程菌株蓝光诱导存活、抗生素杀菌筛选的生长曲线图；
[0037]图5为阿拉伯糖浓度对诱导突变产生的影响结果图。
具体实施方式
[0038]为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株，其特征在于，该工程菌株包括两个单元：突变
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报告单元，用于引入启动子目标蛋白区域的点突变以及改变目标蛋白的荧光特性或改变目标蛋白调控的下游报告蛋白的荧光特性；致死
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筛选单元，用于为光响应合成抗生素保护目标细菌，同时光响应产生活性氧杀死非目标细菌。2.根据权利要求1所述的光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株，其特征在于，所述突变
‑
报告单元选择一个质粒表达，致死筛选单元选择一个质粒表达，构成能够同时表达的双质粒表达系统。3.根据权利要求2所述的光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株，其特征在于，所述突变
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报告单元选择质粒pJN105表达；所述致死筛选单元选择质粒pSUPAR表达。4.根据权利要求3所述的光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株，其特征在于，所述质粒pJN105上载有阿拉伯糖启动子，为表达T7聚合酶RNAP融合的突变蛋白AID732。5.根据权利要求2所述的光遗传学辅助的连续进化筛选工程菌株，其特征在于，与T7聚合酶RNAP融合的突变蛋白AID732用任意一个单碱基突变蛋白替代，或者由多种单碱基突变蛋白同时表达替代。6.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：金帆，黄亚佳，夏爱国，陈盈妙，杨帅，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：