一种分泌表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种分泌表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法和应用。本发明专利技术提供的分泌表达谷氨酰胺酶的基因工程菌株包含如下所述特征：(a)基因组中整合有如下构建物中的一种或两种以上的组合：PamyQ

【技术实现步骤摘要】
一种分泌表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一种分泌表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺酶(glutaminase,EC3.5.1.2)是一种能够催化L
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谷氨酰胺水解生成L
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谷氨酸和氨的酶。谷氨酸在食品工业中有着重要的作用，在增加食品鲜味的同时，增加食品的营养。谷氨酰胺酶广泛存在于细菌、真菌和酵母中，近年来的研究表明谷氨酰胺酶催化作用受pH影响很大，通常在pH为6
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8时发生水解反应，而在pH为8
‑
9时发生转肽反应。
[0003]近年来，谷氨酰胺酶在食品和医学领域中应用研究发展迅速，目前，在食品工业上，谷氨酰胺酶主要应用在酱油的生产中，将酱油中的谷氨酰胺水解为谷氨酸，增加酱油的风味。同时，谷氨酰胺酶在生物技术和生物医药领域也有着极其重要的应用价值，在生物催化方面，谷氨酰胺酶能够转移γ
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谷氨酰基到其他的氨基酸或肽类受体中，形成新的γ
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谷氨酰基衍生物。谷氨酰胺酶的这种转移能力能够被用来进行高附加值γ
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谷氨酰化合物产品的开发，例如L
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茶氨酸。谷氨酰胺酶作用的受体主要为水分子、γ
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谷氨酰基本身和其他氨基酸或二肽，可以催化合成具有免疫调节作用的γ
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Glu
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Trp、治疗帕金森综合症的前体药物γ
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谷氨酰/>‑
L
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多巴、具有抗惊厥作用的γ
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谷氨酰牛磺酸等新型高附加值产品。
[0004]目前谷氨酰胺酶的生产主要以野生型菌株为主，配合基因工程菌的改造，野生型菌株的表达量普遍偏低，且不能分泌表达，基因工程菌的改造主要集中在枯草芽孢杆菌，虽然一定程度提高了谷氨酰胺酶的胞内表达量，但仍然没有实现分泌表达，导致该酶在工业生产中存在提取过程酶活损失较大，酶制剂产品制备困难的问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的表达谷氨酰胺酶的菌株表达量偏低及谷氨酰胺酶不能分泌表达的问题，本专利技术提供一种能够分泌表达谷氨酰胺酶菌株。
[0006]本专利技术提供的菌株能够分泌表达谷氨酰胺酶，解决谷氨酰胺酶不能分泌表达及工业生产中后提取过程中酶活损失较大，酶制剂产品难以高质量制备的难题。
[0007]本专利技术提供一种分泌表达谷氨酰胺酶的基因工程菌株，所述菌株包含如下所述特征：
[0008](a)基因组中整合有如下构建物中的一种或两种以上的组合：PamyQ
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SamyQ，PHpaII
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SamyQ，P43
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SamyQ，Pgrac
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SamyQ，PamyQ
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PHpaII
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SamyQ，PHpaII
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PamyQ
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SamyQ；
[0009]或，(b)细胞中含有包含如下构建物中的一种或两种以上的组合的表达载体：PamyQ
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SamyQ，PHpaII
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SamyQ，P43
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SamyQ，Pgrac
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SamyQ，PamyQ
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PHpaII
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SamyQ，PHpaII
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PamyQ
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SamyQ。
[0010]优选地，所述菌株以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为宿主；
[0011]优选地，所述宿主为保藏编号为CCTCC No：M 2018828的解淀粉芽孢杆菌菌株
(Bacillus amyloliquefaciens)ESP827。
[0012]优选地，宿主的基因位点中的任一个或两个以上位点整合有所述构建物，
[0013]优选地，以宿主的srfA位点为整合有所述构建物。
[0014]优选地，所述表达载体为pUC质粒。
[0015]优选地，所述基因工程菌株为解淀粉芽孢杆菌BAG6
‑
1(Bacillus amyloliquefaciens BAG6
‑
1)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2022849；
[0016]或者，所述基因工程菌株为解淀粉芽孢杆菌BAG6(Bacillus amyloliquefaciens BAG6)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2022850。
[0017]本专利技术还提供所述的基因工程菌株的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
[0018]将所述的构建物整合到宿主细胞的染色体基因组中或将包含构建物的表达载体转化到宿主细胞中。
[0019]优选地，所述构建方法包括：采用基因编辑技术和/或同源重组的方式对宿主细胞进行定向改造，使宿主细胞的基因位点中的任一个或两个以上位点含有所述基因编辑技术和/或同源重组的构建物，
[0020]优选地，使宿主细胞的srfA位点含有所述基因编辑技术和/或同源重组的构建物，
[0021]优选地，所述的基因编辑技术选自ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑中的一种或两种以上的组合，
[0022]优选地，所述的同源重组选自λ
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red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。
[0023]本专利技术还提供所述基因工程菌株或所述的构建方法得到的基因工程菌株在发酵产谷氨酰胺酶中的应用。
[0024]本专利技术还提供所述基因工程菌株或所述的构建方法得到的基因工程菌株在食品添加剂或保健品中的应用；
[0025]优选地，所述食品添加剂为酱油或酵母抽提物。
[0026]本专利技术还提供一种发酵产谷氨酰胺酶的方法，所述方法包含培养所述基因工程菌株或所述的构建方法得到的基因工程菌株。
[0027]优选地，所述菌株的接种量为4％
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8％，
[0028]优选地，发酵温度24℃
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37℃，
[0029]优选地，发酵过程通过补碱维持pH6
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7.0，
[0030]优选地，发酵转速为500
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600rpm，
[0031]优选地，发酵通风比为1：1。
[0032]本专利技术还提供一种重组表达表达载体，所述表达载体含有如下构建物中的一种或两种以上的组合：PamyQ
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SamyQ，PHpaII
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SamyQ，P43
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SamyQ，Pgrac
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SamyQ，PamyQ
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PHpaII
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SamyQ，PHp本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌表达谷氨酰胺酶的基因工程菌株，其特征在于，所述菌株包含如下所述特征：(a)基因组中整合有如下构建物中的一种或两种以上的组合：PamyQ
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SamyQ，PHpaII
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SamyQ，P43
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SamyQ，Pgrac
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SamyQ，PamyQ
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PHpaII
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SamyQ，PHpaII
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PamyQ
‑
SamyQ；或，(b)细胞中含有包含如下构建物中的一种或两种以上的组合的表达载体：PamyQ
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SamyQ，PHpaII
‑
SamyQ，P43
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SamyQ，Pgrac
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SamyQ，PamyQ
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PHpaII
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SamyQ，PHpaII
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PamyQ
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SamyQ。2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述菌株以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为宿主；优选地，所述宿主为保藏编号为CCTCC No：M 2018828的解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)ESP827。3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于，宿主的基因位点中的任一个或两个以上位点整合有所述构建物，优选地，以宿主的srfA位点为整合有所述构建物。4.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于，所述表达载体为pUC质粒。5.根据权利要求1
‑
4任意一项所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为解淀粉芽孢杆菌BAG6
‑
1(Bacillus amyloliquefaciens BAG6
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1)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2022849；或者，所述基因工程菌株为解淀粉芽孢杆菌BAG6(Bacillusamyloliquefaciens BAG6)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2022850。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：郑贤良，肖明华，毛泽敬，陈翱，胡悦，宋婷，张彦，余华顺，
申请(专利权)人：安琪酵母股份有限公司，
类型：发明
国别省市：