一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌，属于农药生物降解技术领域，所述用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.25199。该工程菌可以产生磺酰脲类除草剂去酯化酶，能够降解苯磺隆、氯磺隆、吡嘧磺隆、噻吩磺隆和烟嘧磺隆等磺酰脲类除草剂，可用于水源、土壤中磺酰脲类除草剂污染的生物降解和生物净化。本发明专利技术还提供了一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌的制备方法及应用。及应用。及应用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于农药生物降解
，特别涉及一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]化学农药是现代农业丰收的重要保障，其中除草剂是农业生产要素中最要的组成部分。除草剂的长期、大量、广泛使用促进了粮食丰产，但也对农田土壤及周边生态环境造成了不容忽视的污染，严重威胁农业生产安全与人类的健康。
[0003]目前广泛使用的有8类除草剂，包括有机磷类、磺酰脲类、氯乙酰胺类、均三嗪类、芳氧基苯氧基丙酸酯类、苯氧乙酸类、二硝基苯胺类和硫代氨基甲酸酯类。其中，以草甘膦为代表的有机磷类除草剂是目前世界上销售额最大的非选择性、内吸型除草剂，主要道路、果园等非耕地杂草的防治。磺酰脲类除草剂是世界上使用量最大的第二大类除草剂，也是世界上农田使用量及使用面积最大的一类除草剂，目前已有30多个商品化产品，常见的有甲磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆等，此类除草剂其特性髙效、广谱、低毒、高选择性。
[0004]磺酰脲类除草剂的推广应用己有二十多年的历史，在大田农作物除草方面具有较为明显的优势，磺酰脲类除草剂应用广泛，用量大，施用面积广，并随着杂草抗药性增强，使用量在不断加大，土壤积累量持续增加，长期且超量施用量使其残留在土壤中累积严重，往往对下茬作物产生药害，造成巨大的经济损失和环境污染。磺酰脲类除草剂长期残留不仅会危及非靶标植物，而且会在土壤中通过化学或生物转化以其他有毒代谢物的方式释放出来，会对农田土壤生态环境造成严重破坏。此外，磺酰脲类除草剂极易溶于水，因此其残留物的迁移和淋溶性较强，易在土壤和水环境中流动，由此导致对大面积的后茬作物或水资源产生药害。长效残留除草剂会对环境及经济带来巨大损失，因此研究解决土壤除草剂的残留问题迫在眉睫。其在环境中的生态学行为以及修复已成为是国内外关注和研究的重点。
[0005]磺酰脲类除草剂是一类重要的环境异生物(xenobiotic ompounds)，在土壤中的降解方式主要有微生物降解、光解和化学水解。然而，磺酰脲类除草剂的光解作用通常发生在土壤表层，在较深土层中几乎不发生。微生物的分解作用是磺酰脲类除草剂降解的主要因素。能够对磺酰脲类除草剂有降解作用的土壤微生物主要是细菌、放线菌和真菌。微生物降解除草剂的本质为酶促反应，主要是通过其分泌的酶对除草剂进行代谢来完成。目前，科研工作者己经分离筛选了大量降解除草剂的微生物，并成功地将降解性微生物应用于污染环境的修复。目前已分离到多株磺酰脲类除草剂降解菌株，其中大多数降解菌以断裂脲桥C
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N键的方式为主，如氯嘧磺隆降解菌克雷伯氏菌2N3分离自工业废水处理的活性污泥，对起始浓度为100mg/L的氯嘧磺隆在12h内的降解率为92.5％，并且该菌还能同时降解烟嘧磺隆、甲磺隆、苯磺隆、胺苯磺隆和砜嘧磺隆。甲磺隆降解菌株甲基营养菌株(Methylopila sp.)S113分离自被甲磺隆污染的土壤，其在72h内对50mg/L的甲磺隆的降解率高达97％，同
时也能够降解苄嘧磺隆，噻吩磺隆和胺苯磺隆。然而，野生型的降解菌普遍生长缓慢，营养条件苛刻，受环境的影响较大，将其直接施于土壤中进行污染位点的生物修复，会受到土壤本身的条件以及土著微生物菌群的影响，很难达到生物修复的目的。通过生物学和基因工程的手段构建农药降解基因工程菌株成为新的研究热点。
[0006]目前已报道的磺酰脲类除草剂降解基因较少，其中，磺酰脲类除草剂去酯化酶基因SulE，能水解芳环上含有酯结构的磺酰脲类除草剂。研究发现，将SulE导入到酵母菌BY4741可显著提高该菌对噻吩磺隆和甲磺隆的耐受性，表明SulE是一个理想的抗除草剂转基因工程的除草剂脱毒酯酶。
[0007]SulE由于具有广泛的磺酰脲类除草剂底物范围和较高的催化效率，是至今最有应用前景的磺酰脲类除草剂降解酶，将其相应的基因克隆与表达可以构建降解谱广、降解彻底的工程菌，为微生物降解农药开辟新途径，也可将降解酶基因转入易于繁殖的宿主中获得高表达，提高酶产率，这将成为生物降解除草剂、治理土壤污染和土壤地力修复的研究方向和趋势。
[0008]从除草剂污染的污泥或农田分离的有较好降解效果的野生菌，当被应用到异位污染土壤进行生物修复的时候，由于除草剂降解菌施到污染土壤中受到土壤的复杂环境和土著微生物竞争的影响，不能成为优势菌群，往往其存活状态和修复效果不佳。因此，通过基因工程的手段将磺酰脲类除草剂降解基因构建到适合在土壤中作用的株菌中，获得遗传稳定的，符合环境释放条件，同时能高效表达降解活性的工程菌株有重要的应用价值和意义。

技术实现思路

[0009]为了解决现有除草剂降解菌在污染土壤中修复效果不佳的技术问题，本专利技术提供了一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌，该工程菌可以产生磺酰脲类除草剂去酯化酶，能够降解苯磺隆、氯磺隆、吡嘧磺隆、噻吩磺隆和烟嘧磺隆等磺酰脲类除草剂，可用于水源、土壤中磺酰脲类除草剂污染的生物降解和生物净化。
[0010]本专利技术还提供了一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌的制备方法及应用。
[0011]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0012]本专利技术提供一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌(Bacilus subtilis sp.XP1)，所述用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.25199，保藏日期2022年6月27日，保藏地址中国北京。
[0013]进一步的，所述用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌含有编码磺酰脲类除草剂去酯化酶基因SulE，所述用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌能够表达磺酰脲类除草剂去酯化酶，所述基因SulE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]具体的，所述基因SulE的核苷酸序列如下：
[0015]ATGGAAACCGATAAAAAAACCGGAACGTCCCGCAGATCATTTGTGTGAAGGCTGCTGGAACCGGCGCAATAGGAATAGCGACGCTGCCGCTTTCGACTGCAACTGCTTTCGCGGAAACTGACAACGTGGAGCTTGCCCAATCGAAGCGGAAGGTTGTCCTTGCTGAACAAGGCAGTTTCTACATCGGGGGCAGAACAGTAACCGGGCCTGGAAAATTCGATCCGTCAAAGCCGGTAATTCCATATTCCAACGAAGGTGCCACGTTTTATATCAATCAAATGTACGTAAACTTTCAAGCTCCTGTGCGCCCTCGTGGGCTGCCTCTAGTCTTTTGGCATGGGGGCGGACTAACCGGCCATATCTGGGAATCTA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌(Bacilus subtilis sp.XP1)，其特征在于，所述用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.25199。2.根据权利要求1所述的一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌，其特征在于，所述用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌含有编码磺酰脲类除草剂去酯化酶基因SulE，所述用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌能够表达磺酰脲类除草剂去酯化酶，所述基因SulE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将编码磺酰脲类除草剂去酯化酶基因SulE转化至E.coli DH5αλpir，获得供体菌E.coli DH5αλpir
‑
SulE；以枯草芽孢杆菌168为受体菌，以E.coliWD803(pRK2013)为辅助转移菌，与所述供体菌E.coli DH5αλpir
‑
SulE进行三亲杂交，采用以磺酰脲类除草剂为唯一碳源的基础培养基进行培养和筛选，选取以磺酰脲类除草剂为唯一碳源的基础培养基平板上具有水解圈的菌落，即得到用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌。4.根据权利要求3所述的一种用于降解磺酰脲类除草剂的工程菌的制备方法，其特征在于，所述将编码磺酰脲类除草剂去酯化酶基因SulE转化至E.coli DH5αλpir，获得供体菌E.coli DH5αλpir
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SulE，具体包括：合成SulE DNA片段，所述SulE DNA片段上游含有BamHⅠ酶切位点，下游含有SacⅠ酶切位点，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ分别酶切载体pBBR1 MCS
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2和所述SulE DNA片段，去磷酸化后，酶连构建质粒pBBR

【专利技术属性】
技术研发人员：李同祥，汤薇，黄天姿，孙会刚，张传丽，田林，李昭，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：