一株高效合成脂多糖的基因工程菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一株高效合成脂多糖的基因工程菌的构建方法及其应用，属于遗传工程技术领域。本发明专利技术的基因工程菌E.coliW3110

【技术实现步骤摘要】
一株高效合成脂多糖的基因工程菌的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一株高效合成脂多糖的基因工程菌的构建方法及其应用，属于遗传工程

技术背景
[0002]在哺乳动物细胞体内存在多种Toll样受体(TLRs)，特定的TLR识别入侵体内的细菌、真菌和病毒的特定结构成分，如肽聚糖、LPS、脂质、糖链、肽、RNA或DNA。LPS是已知最活跃的病原体相关分子模式(pathogen
‑
associated molecularpatterns，PAMPs)之一，皮克级就能够引起免疫反应。脂多糖介导的信号转导是机体自身防御反应的重要环节。脂多糖的类脂A，可以被宿主细胞表面的病原体识别受体TLR4(Toll
‑
like receptor)识别。识别后可以激活胞内信号级联反应，释放多种促炎性细胞因子如IL
‑
6、IL
‑
8、TNF
‑
α，并产生最终激活体液和细胞反应的共刺激分子。
[0003]当接种天然含有LPS等细菌成分的疫苗，如减毒疫苗、灭活疫苗，或者接种纯化抗原佐以LPS或其衍物的疫苗后，都能够增强疫苗的免疫强度。这种为抗原提供“帮助”的分子被定义为疫苗佐剂，免疫佐剂对于免疫应答的产生和增强具有重要作用。脂多糖是体现革兰氏阴性菌毒力的活性成分，其关键结构为类脂A，不同结构的类脂A有不同的免疫功能。人们通过基因工程改造可以获得不同结构的脂多糖或类脂A结构，以获得不同功能的疫苗佐剂或免疫实验试剂，如MPL、MPLA和Kdo2‑
lipidA等。但是天然合成这些脂多糖分子的大肠杆菌菌株产量较低。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术是构建了一株无抗性且遗传背景很清晰的生产脂多糖的大肠杆菌基因工程菌，通过基因编辑手段合理增强脂多糖合成途径，有效提高了脂多糖合成量。本专利技术的合成脂多糖的基因工程菌，无任何抗性标记、生长状况良好、可适应大规模生产。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供的基因工程菌，所述基因工程菌的npr、yhbJ和fabF发生缺失突变失活，基因簇lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB序列前面插入启动子P
BAD
。
[0006]所述基因工程菌为E.coli W3110
△
npr
△
yhbJ
△
fabF
△
P
BAD(lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB)
，是在大肠杆菌W3110的基础上构建得到的，命名为菌株WOZF01。
[0007]本专利技术中，npr、yhbJ、fabF基因缺失片段的氨基酸序列，分别是NCBI上"BAE77250.1"、"BAE77249.1"、"BAA35903.1"所示的序列。
[0008]本专利技术中，启动子P
BAD
的序列是SEQ ID NO.37所示的序列。
[0009]本专利技术中，基因簇lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB前插入启动子P
BAD
，直接在原染色体上进行表达。
[0010]在一种实施方式中，所述缺失突变失活是采用基因敲除的方法。
[0011]在一种实施方式中，所述缺失突变是采用CRISPR
‑
Cas9敲除系统，在大肠杆菌
W3110中进行基因敲除。
[0012]在一种实施方式中，所述敲除，是使用CRISPR
‑
Cas9敲除系统的Cas酶介导的片段重组，最终42℃培养去除pCas质粒，获得无抗性有效合成脂多糖的基因工程菌。
[0013]本专利技术还提供一种利用所述基因工程菌生产脂多糖的方法。
[0014]在一种实施方式中，所述方法，是添加阿拉伯糖诱导发酵方法。
[0015]在一种实施方式中，所述方法中，阿拉伯糖添加终浓度在22.5mM的LB液体培养基发酵。
[0016]在一种实施方式中，所述方法中，发酵条件为37℃，200rpm。
[0017]本专利技术还提供所述基因工程菌的应用，是利用基因工程菌生产脂多糖，然后将脂多糖用于细胞免疫或者制备含有脂多糖成分的疫苗。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术的基因工程菌E.coli W3110
△
npr
△
yhbJ
△
fabF
△
P
BAD(lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB)
，发生了npr、yhbJ和fabF三基因缺失突变，同时在染色体基因簇lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB序列前面插入了启动子P
BAD
。本专利技术的基因工程菌，无任何抗性标记、生长状况良好、可适应大规模生产，合成脂多糖的产量为13.0mg/gDCW，较野生型E.coli W3110提高了91.2％。
附图说明
[0020]图1：基因工程菌E.coli W3110
△
npr
△
yhbJ
△
fabF
△
P
BAD(lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB)
(WOZF01)脂多糖的SDS
‑
PAGE银染分析；
[0021]图2：基因工程菌E.coli W3110
△
npr
△
yhbJ
△
fabF
△
P
BAD(lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB)
(WOZF01)脂多糖产量分析；
[0022]图3：菌株E.coliW3110、基因工程菌E.coli W3110
△
npr
△
yhbJ
△
fabF(WOZF)和E.coliW3110
△
npr
△
yhbJ
△
fabF
△
P
BAD(lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB)
(WOZF01)生长曲线；
[0023]图4：重组菌株WOZF/pWSK29
‑
DZAB的脂多糖的SDS
‑
PAGE银染分析和定量分析。
具体实施方式
[0024]1、脂多糖提取方法：
[0025]采用热酚水解法提取大肠杆菌的LPS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的npr、yhbJ和fabF发生缺失突变失活，基因簇lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB序列前面插入启动子P
BAD
。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌W3110的基础上构建得到的，为E.coliW3110
△
npr
△
yhbJ
△
fabF
△
P
BAD(lpxD
‑
fabZ
‑
lpxA
‑
lpxB)
。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，npr、yhbJ、fabF基因缺失片段的氨基酸序列，分别是NCBI上"BAE77250.1"、"BAE77249.1"、"BAA35903.1"所示的序列。4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，启动子P
BAD
的序列是SEQ ID NO.37所示的序列。5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建，通过CRISPR
‑
Cas9敲除系统，在npr、yhbJ和fabF发生缺失突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建莉，马文渐，王小元，陈姜铧，叶梓琪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：