一种高效定向电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法及用途，涉及生物能源技术领域。本发明专利技术利用PCR获得希瓦氏菌内源编码乳酸透过酶基因SO1522，编码NAD

【技术实现步骤摘要】
一种高效定向电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法及用途


[0001]本专利技术涉及生物能源
，更具体的说是涉及一种高效定向电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法及用途。

技术介绍

[0002]微生物燃料电池是利用电活性微生物的细胞内生理代谢和细胞外电子传递，将储存在有机物中的化学能转换为电能的一种新兴且有良好前景的生物技术。其中，电活性微生物作为核心催化剂，其催化活性能直接决定着微生物燃料电池的性能。
[0003]希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR
‑
1(简称S.oneidensis MR
‑
1)是在基因组序列注释和遗传特性方面研究最充分的外产电菌之一，其细胞内代谢路径和细胞外电子传递机制已被广泛研究和阐明。希瓦氏菌S.oneidensis MR
‑
1的产电机制主要是通过氧化电子供体产生生物电子，并在细胞内以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的形式储存，随后在NADH氧化脱氢酶催化下将电子释放至胞外电子转移途径，随后通过直接电子传递或间接电子传递的方式将电子传递到微生物燃料电池的阳极。近年来，利用合成生物学策略强化胞外电子传递过程已被广泛研究，包括可利用葡萄糖、木糖的希瓦氏底盘菌改造以拓宽希瓦氏菌底物谱，胞内NAD
+
的从头合成和胞内NADH再生的强化以增强细胞内可释放电子池和希瓦氏菌的胞外电子传递速率。然而，从电子供体至电子转移链的电子通量低仍是影响胞外电子传递效率的关键因素。
专利技术内容
[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的用途。
[0007]本专利技术的技术方案概述如下：
[0008]一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：PCR获得希瓦氏菌内源编码乳酸透过酶基因SO1522，编码NAD
+
依赖型氧化酶基因gapA和mdh，以及编码NADH氧化脱氢酶基因ndh，在希瓦氏菌中逐步串联表达上述基因得到高效定向电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株SA
‑
E；
[0009]本研究使用无缝克隆连接的方式构建质粒。片段与片段见存在同源臂，利用重叠PCR可获得四个基因片段连在一起的一个完整基因片段；同时将载体(环状空质粒)进行反向PCR获得线性化载体，之后利用无缝克隆连接酶将线性化载体和基因片段连接为目标质粒。
[0010]有益效果：本专利技术通过逐级串联表达希瓦氏菌内源性的内膜乳酸通透酶基因SO1522，调控细胞内NADH再生的NAD+依赖型氧化酶基因gapA和mdh，以及细胞内膜上编码NADH氧化脱氢酶的基因ndh，构建了一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株。该菌株不仅能够提高了MFCs的电化学性能，而且弥补希瓦氏菌强化胞内电子通量至电子传递链的研究空缺。
[0011]本专利技术构建了一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株，该菌株能够强化底物摄取、加快细胞内NADH再生和促进NADH氧化脱氢释放电子，进而高效地将胞内电子通量从电子供体定向至电子转移链，从而增强胞外电子传递速率，提高微生物燃料电池的输出功率。
附图说明
[0012]图1为希瓦氏菌MR
‑
1与重组希瓦氏菌株SA
‑
E MFCs的输出电压对比图；
[0013]图2为希瓦氏菌MR
‑
1与重组希瓦氏菌株SA
‑
E MFCs的电化学表征图；
[0014]图3为希瓦氏菌MR
‑
1与重组希瓦氏菌株SA
‑
E MFCs的乳酸消耗表征图；
[0015]图4为希瓦氏菌MR
‑
1与重组希瓦氏菌株SA
‑
E MFCs的胞内NADH含量表征图。
具体实施方式:
[0016]本专利技术实施例中，野生型希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR
‑
1，简称野生型希瓦氏菌S.oneidensis MR
‑
1，于2010年9月购自ATCC(美国，https://www.atcc.org/)公司的ATCC 700550菌株。
[0017]实施例1
[0018]一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法
[0019]包括如下步骤：PCR获得希瓦氏菌内源编码乳酸透过酶基因SO1522，编码NAD
+
依赖型氧化酶基因gapA和mdh，以及编码NADH氧化脱氢酶基因ndh，利用无缝克隆技术连接到pYYDT载体，转入野生型希瓦氏菌S.oneidensis MR
‑
1中得到重组希瓦氏菌株SA
‑
E。
[0020]所述基因SO1522的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0021]所述基因gapA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0022]所述基因mdh的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0023]所述基因ndh的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0024]具体构建方法包括如下步骤：
[0025]1.引物设计(人工合成)
[0026]从NCBI数据库获得希瓦氏菌MR
‑
1的基因组序列，根据基因SO1522、gapA、mdh与ndh及其上下游基因序列设计四对引物，SO1522
‑
U(SEQ ID NO.5)和SO1522
‑
D(SEQ ID NO.6)、gapA
‑
U(SEQ ID NO.7)和gapA
‑
D(SEQ ID NO.8)、mdh
‑
U(SEQ ID NO.9)和mdh
‑
D(SEQ ID NO.10)、ndh
‑
U(SEQ ID NO.11)和ndh
‑
D(SEQ ID NO.12)；根据完整环状pYYDT质粒图谱信息，确定合适的目的基因插入位点，并根据上下游基因序列设计一对引物，LV
‑
U(SEQ ID NO.13)和LV
‑
D(SEQ ID NO.14)。其中引物LV
‑
D和SO1522
‑
U、SO1522
‑
D和gapA
‑
U、gapA
‑
D和mdh
‑
U、mdh
‑
D、ndh
‑
U、ndh
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株SA
‑
E，其特征在于，所述重组希瓦氏菌株SA
‑
E以希瓦氏菌株为基础菌株，并在所述基础菌株的基因组中逐级串联表达希瓦氏菌内源编码乳酸通透酶基因SO1522，编码NAD
+
依赖型氧化酶基因gapA和mdh，以及编码NADH氧化脱氢酶基因ndh。2.根据权利要求1所述重组希瓦氏菌株SA
‑
E，其特征在于，所述希瓦氏菌内源编码乳酸通透酶基因SO1522，编码NAD
+
依赖型氧化酶基因gapA和mdh，以及编码NADH氧化脱氢酶基因ndh均通过PCR扩增得到。3.根据权利要求2所述重组希瓦氏菌株SA
‑
E，其特征在于，所述PCR扩增的引物对包括：针对希瓦氏菌内源编码乳酸通透酶基因SO1522设计的引物对包括SO1522
‑
U和SO1522
‑
D；所述SO1522
‑
U的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SO1522
‑
D的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；针对编码NAD
+
依赖型氧化酶基因gapA设计的引物对包括gapA
‑
U和gapA
‑
D；所述gapA
‑
U的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述gapA
‑
D的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；针对编码NAD
+
依赖型氧化酶基因mdh设计的引物对包括mdh
‑
U和mdh
‑
D；所述mdh
‑
U的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述mdh
‑
D的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；针对编码NADH氧化脱氢酶基因ndh设计的引物对包括ndh
‑
U和ndh
‑
D；所述ndh
‑
U的核苷酸序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锋，丁钦然，刘其敬，宋浩，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：