一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种高产L

【技术实现步骤摘要】
一种高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用
(一)

[0001]本专利技术属于代谢工程领域，具体涉及一种高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备L
‑
半胱氨酸中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]L
‑
半胱氨酸(L
‑
Cys)是生物体内常见的硫源供体，其L型具有生物学活性。L
‑
Cys是蛋氨酸、硫胺素以及谷胱甘肽等生物体内常见物质的重要组成成分。L
‑
Cys通过形成二硫键和蛋白质过硫酸化在蛋白质折叠、组装和信号转导中发挥重要作用。此外，L
‑
Cys在氧化压力下对细胞起保护作用。作为生物体中一种重要氨基酸，L
‑
Cys在医药、食品、化妆品和饲料行业中有广泛应用。例如L
‑
半胱氨酸衍生药物有镇咳退热，消炎化痰，抑菌生长等作用，还能防治皮肤病，改善化疗造成的伤害等多种功能。L
‑
Cys也可作为面包添加剂、增香剂和发色剂等食品添加剂大量使用。
[0003]相比工业化方法生产L
‑
Cys的繁琐步骤以及对环境的污染，微生物的发酵方法已经成为一种极具前景的生产技术。由于L
‑
Cys自身对细胞的毒性以及具有还原铁和驱动芬顿化学的理化性质等因素，细菌严格调节其细胞质水平，导致野生型大肠杆菌中原始的L
‑
Cys积累水平很低，所以采用微生物发酵的方法依然面临着巨大的挑战。L
‑
Cys的生物合成途径和调节机制已被广泛研究。因此通过基因工程、代谢工程等生物技术对L
‑
Cys生产菌株进行改造，以减轻L
‑
Cys对于细胞自身的毒性和提高L
‑
Cys代谢途径的通量，是一种有效的得到L
‑
Cys高产菌株的策略。
[0004]代谢工程控制微生物的细胞代谢，以最大限度地生产增值产品，同时也可能会导致细胞代谢网络失衡，从而降低生产率和产量。代谢通量可以通过动态调节来重新平衡，群体感应(QS)系统被认为是一种由细胞密度调节的自动诱导系统。特定的信号小分子在细胞中积累，诱导QS回路的激活，可用于动态调节目标基因的表达。群体感应功能控制细菌中的细胞密度依赖过程，并已应用于诱导重组蛋白表达、控制赖氨酸和平衡多个细胞群体等。Esa群体感应系统被用于下调相互竞争的代谢途径以及控制lacI的表达。小分子AHL由AHL合成酶EsaI产生。在AHL浓度水平较低的情况下，转录调节因子EsaR可以与启动子P
esaS
结合并激活其转录。随着细胞的生长，AHL逐渐实现积累，EsaR能够与AHL结合形成复合物。这种复合物的形成会导致EsaR对启动子PesaS的激活作用丧失，从而无法激活启动子PesaS的转录，实现表达水平的下调。
[0005]在许多工程菌株中，启动子P
Trc
通常用于驱动基因过表达。P
Trc
是一种常见的杂合启动子，其转录受到LacI蛋白的抑制。在IPTG诱导下，阻遏蛋白LacI可以与IPTG结合形成复合物，无法继续与P
Trc
启动子上的乳糖操纵子结合位点结合，从而导致P
Trc
启动子的转录。但是使用诱导剂这种基因表达方式也存在一些缺陷，比如在大规模的工业生产中，使用诱导剂的成本较高，且此类诱导具有不可逆性，一经添加便会长期存在于介质中，只能起到单次控制的效果。此外，需要定期监测细胞生长状况已确定最佳的诱导时间较为烦琐等。这些缺陷给传统合成生物学的工业化造成了一定的障碍。
(三)
技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利构建了QSI动态调控系统，并应用到生产L
‑
半胱氨酸的大肠杆菌工程化菌株中，获得一种高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌。
[0007]为实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
[0009](1)以菌株E.coil W3110为底盘菌株，将其基因组上的lacI基因替换成转录调节因子esaR
I70V
和AHL合成酶esaI，在基因esaR
I70V
后添加终止子T
lpd
，在基因esaI后添加终止子T
rpoC
，得到菌株E.coil W3110::esaR
I70V
::esaIΔlacI；
[0010](2)将菌株E.coil W3110::esaR
I70V
::esaIΔlacI的cysM基因和nrdH基因的启动子替换为P
Trc
启动子，得到菌株E.coilW3110EYC::esaR
I70V
::esaI::cysM::nrdHΔlacI；
[0011](3)将质粒pTrc99a
‑
P
Trc
‑
cysE
‑
ydeD
‑
serC
‑
cysB上的基因lacI的启动子替换为P
esaS
，并在基因lacI的终止密码子前添加LAA降解标签，构建得到发酵质粒pTrc99a
‑
P
esaS
‑
lacI(LAA)
‑
P
Trc
‑
cysE
‑
ydeD
‑
serC
‑
cysB，将其导入将步骤(2)所得菌株中，得到E.coilW3110::esaR
I70V
::esaI::P
Trc
‑
cysM::P
Trc
‑
nrdHΔlacI/pTrc99a
‑
P
esaS
‑
lacI(LAA)
‑
P
Trc
‑
cysE
‑
ydeD
‑
serC
‑
cysB，即为所述高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌。
[0012]本专利技术所构建的菌株，能够根据自身的细胞密度，动态地激活受P
Trc
启动子控制下的靶基因的表达，实现以下目标：在细胞生长前期，细胞菌体密度低，受QSI系统控制的，参与L
‑
半胱氨酸合成的基因的表达被抑制，细胞代谢流主要用于细胞的生长；随着细胞的生长，菌体密度开始增加，受QSI系统控制，参与L
‑
半胱氨酸合成的基因的表达逐渐被激活，发酵开始进入生产阶段，以此实现细胞生长和产物生成的动态分离，该动态调控策略对于生产有毒化合物的工程菌株的性能具有积极的影响。
[0013]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：(1)以菌株E.coil W3110为底盘菌株，将其基因组上的lacI基因替换成转录调节因子esaR
I70V
和AHL合成酶esaI，在基因esaR
I70V
后添加终止子T
lpd
，在基因esaI后添加终止子T
rpoC
，得到菌株E.coil W3110::esaR
I70V
::esaIΔlacI；(2)将菌株E.coil W3110::esaR
I70V
::esaIΔlacI的cysM基因和nrdH基因的启动子替换为P
Trc
启动子，得到菌株E.coilW3110EYC::esaR
I70V
::esaI::cysM::nrdHΔlacI；(3)将质粒pTrc99a
‑
P
Trc
‑
cysE
‑
ydeD
‑
serC
‑
cysB上的基因lacI的启动子替换为P
esaS
，并在基因lacI的终止密码子前添加LAA降解标签，构建得到发酵质粒pTrc99a
‑
P
esaS
‑
lacI(LAA)
‑
P
Trc
‑
cysE
‑
ydeD
‑
serC
‑
cysB，其中LAA为降解标签，将其导入将步骤(2)所得菌株中，得到E.coilW3110::esaR
I70V
::esaI::P
Trc
‑
cysM::P
Trc
‑
nrdHΔlacI/pTrc99a
‑
P
esaS
‑
lacI(LAA)
‑
P
Trc
‑
cysE
‑
ydeD
‑
serC
‑
cysB，即为所述高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌。2.如权利要求1所述的高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于所述转录调节因子esaR
I70V
的序列如SEQ ID NO.1所示，所述AHL合成酶esaI的序列如SEQ ID NO.2所示。3.构建权利要求1所述高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌的方法，其特征在于所述方法如下：(1)以菌株E.coil W3110为底盘菌株，应用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，将其基因组上的lacI基因替换成转录调节因子esaR
I70V
和AHL合成酶esaI，在基因esaR
I70V

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，杨辉，张博，吴梓丹，潘佳园，陈立峰，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：