一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌及其在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌及其在制备10

【技术实现步骤摘要】
一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌及其在制备10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸中的应用


[0001]本专利技术涉及一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌及其在制备10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸中的应用，属于微生物发酵


技术介绍

[0002]10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸(10
‑
HDA)作为蜂王浆的质量指标，具有抗菌、降低血糖、提高免疫力等各种优良性能。近年来，人们生活水平不断提升，对个人健康及相关健康产业也更加重视，对具有多种生理活性的10
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HDA也越来越关注。该化合物的结构如下：
[0003][0004]迄今为止，获取10
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HDA的方法主要有提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取方法较多，包括乙醚萃取法、乙醇提取法等。但是蜂王浆中10
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HDA的含量较少，难以满足市场的广泛需求，且提取成本较高。自上世纪六十年代以来，多种化学合成10
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HDA的途径被人们设计出来应用生产，如Doebmer缩合法，该方法的底物是1,6
‑
己二醇，产率是61％；缩合法，该方法以γ
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溴丁烯酸乙酯Grignard和有机镁化合物为底物，经过两者缩合生成10
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HDA，该方法的产率达到70％。以上实验方法均可以得到10
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HDA，但是化学合成法具有不可避免的缺点，比如：生产条件苛刻，易产生污染等，而且原料不易获得、合成路线较长、产率偏低，且化学合成存在着顺反异构问题，产品单一性差。所以基于生物合成方法生产10
‑
HDA成为研究的新方向。
[0005]中国专利文献CN 109402182 A(申请号201811126048.1)公开了一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10
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羟基
‑2‑
癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建含有重组质粒pET
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28a
‑
ydiI的大肠杆菌工程菌；(2)取含有重组质粒pET
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28a
‑
ydiI的大肠杆菌工程菌，制备诱导细胞；(3)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入10
‑
羟基癸酸，制备10
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羟基
‑2‑
癸烯酸。该专利文献的10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸的合成途径：以10
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羟基癸酸为反应底物，依赖β氧化的前两步，形成反式双键后，经过大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶ydiI水解辅酶A，释放10
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羟基
‑2‑
癸烯酸。
[0006]中国专利文献CN 109897870 A(申请号201910088897.0)公开了一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10
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羟基
‑2‑
癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建重组质粒pBbB5K
‑
P450融合酶、重组质粒pBbB5K
‑
FadK、重组质粒pBbB5K
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MCAD、重组质粒pBbB5K
‑
YdiI；(2)构建pBbB5K
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ydiI
‑
MCAD
‑
FadK
‑
P450融合酶组合质粒；(3)融合酶组合质粒转化大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；(4)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸，培养，制得10
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羟基
‑2‑
癸烯酸。该专利文献的10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸的合成途径：利用底物癸酸经两步法生产10
‑
HDA，第一步反应先由癸酸到反式
‑2‑
癸烯酸，癸酸在脂酰CoA合成酶FadK的作用下加上辅酶A形成癸酰
‑
CoA，然后癸酰
‑
CoA在脂酰CoA
脱氢酶MCAD的作用下将癸酰
‑
CoA的羧基邻位(β
‑
位)，脱下两个氢原子转化为反式
‑
癸烯酰
‑
CoA，最后反式
‑
癸烯酰
‑
CoA在脂酰CoA硫酯酶YdiI的作用下脱掉辅酶A形成反式
‑2‑
癸烯酸；第二步反应为反式
‑2‑
癸烯酸在P450融合酶的作用下末端羟基化形成10
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羟基
‑2‑
癸烯酸。
[0007]中国专利文献CN 113106109 A(申请号202110211118.9)公开了一种突变酶CYP153A M228L及其在合成10
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羟基
‑2‑
癸烯酸中的应用，具体涉及的突变酶CYP153A M228L是将CYP153A酶第228位的氨基酸由M突变为L；以癸酸为原料两步法生物合成10
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羟基
‑2‑
癸烯酸的方法，主要包括构建优化后重组质粒pCDFDuet
‑1‑
MaMACS
‑
PpFadE、优化后重组质粒pET21b
‑
CYP153A M228L
‑
CPR
BM3
、优化后重组质粒pET28a
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SUMO
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ctYdiI；构建大肠杆菌重组菌制得静息细胞，进一步培养制得10
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羟基
‑2‑
癸烯酸。该专利文献在专利文献CN 109897870 A(申请号201910088897.0)的基础上进行了优化，利用两步法生成10
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HDA，且其中的脂酰CoA脱氢酶基因PpFadE、脂酰CoA合成酶基因MaMACS、酰辅酶A硫酯酶基因ctydiI与中国专利文献CN109897870A(申请号：201910088897.0)中脂酰CoA脱氢酶基因MCAD、脂酰CoA合成酶基因FadK、酰辅酶A硫酯酶基因ydiI并非相同基因，烷烃羟化酶CYP153A是将228位的氨基酸由M变为L，10
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羟基
‑2‑
癸烯酸的转化率提高至54.6％。
[0008]开发更多样的10
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羟基
‑2‑
癸烯酸合成途径，对于10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸的工业化生产仍然是有必要的。

技术实现思路

[0009]本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，并利用该工程菌以10
‑
羟基癸酸为底物一步反应制备10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌中包括脂酰辅酶A氧化酶基因和脂酰辅酶A硫酯酶基因。2.如权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述脂酰辅酶A氧化酶基因来源于热带假丝酵母或解脂耶氏酵母，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；所述脂酰辅酶A硫酯酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。3.如权利要求2所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述脂酰辅酶A氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9，所述脂酰辅酶A硫酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。4.如权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌或酿酒酵母。5.权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：(1)构建重组质粒pETDuet
‑1‑
ACO、pET28a
‑
SUMO
‑
ACOT、pESC
‑
URA
‑
SUMO
‑
ACOT；所述脂酰辅酶A氧化酶ACO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述脂酰辅酶A硫酯酶ACOT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；(2)将步骤(1)的重组质粒pETDuet
‑1‑
ACO和pET28a
‑
SUMO
‑
ACOT共同转化到大肠杆菌中，经筛选、鉴定后，得到大肠杆菌基因工程菌；将步骤(1)的重组质粒pETDuet
‑1‑
ACO和pESC
‑
URA
‑
SUMO
‑
ACOT共同转化到酿酒酵母中，经筛选、鉴定后，得到酿酒酵母基因工程菌。6.权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌在以10
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羟基癸酸为底物制备10
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羟基
‑2‑
癸烯酸中的应用。7.利用含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌以10
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羟基癸酸为底物制备10
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羟基
‑2‑
癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：将权利要求5构建的大肠杆菌基因工程菌经诱导培养后制得诱导细胞，将诱导细胞接入转化培养基中，并加入1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞明，方轲，汪俊卿，李丕武，苏静，王婷，刘慧婧，崔泉，杜博闻，杨露，徐子婷，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：