一种用于红球菌基因敲除的重组系统及其应用技术方案

本发明专利技术属于细胞工程技术领域，具体涉及一种用于红球菌基因敲除的重组系统及其应用。包括：Che9c60&61重组酶质粒、Flp重组酶和游离双链DNA敲除盒片段；游离双链DNA敲除盒片段包括：目的基因上下游同源臂序列及在其间插入包含抗性基因的两个同向FRT序列；Flp重组酶质粒的基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。该用于红球菌基因敲除的重组系统可以有效对红球菌进行无痕敲除，庆大霉素抗性丢失效率达到了100％和78.7％；而且本发明专利技术基于FRT位点特异性重组酶Flpw方法可有效实现红球菌Rhodococcus ruber R1的高效无痕敲除，为下一轮基因编辑(多基因敲除)回收抗性基因。轮基因编辑(多基因敲除)回收抗性基因。轮基因编辑(多基因敲除)回收抗性基因。

【技术实现步骤摘要】
一种用于红球菌基因敲除的重组系统及其应用


[0001]本专利技术属于细胞工程
，具体涉及一种用于红球菌基因敲除的重组系统及其应用。

技术介绍

[0002]红球菌属(Rhodococcus)是一种需氧的、非运动的、无芽孢的和细胞壁含有分枝酸的革兰氏阳性细菌，介于分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)和棒状杆菌属(Corynebacterium)之间。红球菌广泛分布于从海洋到陆地的不同环境中，能适应恶劣环境，具有多种有机物的降解代谢活性，如单芳烃、多芳烃、酚类、卤代烃、硝基芳香烃、腈和其它芳香族化合物。虽然人们开始认识到红球菌在生物降解、转化和合成等领域的应用潜力，但是红球菌基础研究的数量却远不及大肠杆菌和芽孢杆菌等较为成熟的工程菌。人们对红球菌的了解并未深入。而红球菌的基因敲除工具对于人们开展红球菌的基础研究非常重要。
[0003]目前，红球菌可用的基因敲除工具非常少，而且现有的传统同源重组技术在红球菌的基因敲除中表现出重组效率低的特点。现有研究发现通过分枝杆菌噬菌体重组酶Che9c60&61可以准确、高效地对红球菌基因进行编辑，但是这种方式会在基因敲除的过程中引入抗生素抗性基因，导致无法进行多轮基因编辑。
[0004]因此，研发一种重组效率高，且可以进行多轮基因编辑的可以用于红球菌基因敲除的重组系统是有必要的。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术目的之一在于提供一种用于红球菌基因敲除的重组系统。该重组系统基于FRT位点特异性重组酶Flpw方法可有效对红球菌进行高效无痕敲除，为下一轮基因编辑(多基因敲除)回收了抗性基因。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术可以采用以下技术方案：
[0007]本专利技术一方面提供一种用于红球菌基因敲除的重组系统，其包括：Che9c60&61重组酶质粒、Flp重组酶和游离双链DNA敲除盒片段；游离双链DNA敲除盒片段包括：目的基因上下游同源臂序列及在其间插入包含抗性基因的两个同向FRT序列；Flp重组酶质粒的基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
[0008]本专利技术另一方面提供一种基因工程红球菌的构建方法，包括：使用上述用于红球菌基因敲除的重组系统对红球菌进行基因敲除得基因工程红球菌。
[0009]本专利技术再一方面提供一种上述的基因工程红球菌的构建方法构建的基因工程红球菌。
[0010]本专利技术再一方面提供一种Flp重组酶基因序列，其包括如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示序列。
[0011]本专利技术再一方面提供一种上述用于红球菌基因敲除的重组系统或上述的Flp重组
酶基因序列在红球菌基因编辑中的应用。
[0012]本专利技术有益效果包括：本专利技术提供的用于红球菌基因敲除的重组系统可以有效对红球菌进行无痕敲除，庆大霉素抗性丢失效率达到了100％和78.7％；而且本专利技术基于FRT位点特异性重组酶Flpw方法可有效实现红球菌Rhodococcus ruber R1的高效无痕敲除，为下一轮基因编辑(多基因敲除)回收抗性基因。
附图说明
[0013]图1为amiE2基因敲除盒片段构建示意图；
[0014]图2为pBNVW质粒构建示意图；
[0015]图3为Rhodococcus ruber R1与其突变株PCR验证；
[0016]图4为Rhodococcusruber R1与其突变株测序验证；
[0017]图5为Rhodococcus ruber R1ΔamiE2::FRT
‑
Gm
‑
FRT的抗性丢失点板筛选；
[0018]图3中，注：泳道1、2、3是依次以Rhodococcus ruber R1、Rhodococcus ruber R1ΔamiE2::FRT
‑
Gm
‑
FRT、Rhodococcus ruber R1ΔamiE2为模板，amiE2
‑
P9/P10引物扩增出的DNA片段；M表示Marker。
具体实施方式
[0019]所举实施例是为了更好地对本专利技术进行说明，但并不是本专利技术的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。
[0020]本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本专利技术的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
[0021]本专利技术一实施例提供一种用于红球菌基因敲除的重组系统，其包括：Che9c60&61重组酶质粒、Flp重组酶和游离双链DNA敲除盒片段；游离双链DNA敲除盒片段包括：目的基因上下游同源臂序列及在其间插入包含抗性基因的两个同向FRT序列；Flp重组酶质粒的基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
[0022]需要说明的是，SEQ ID NO.1所示序列是flp基因序列，SEQ ID NO.3所示序列进行红球菌密码子优化(也称flpw基因)，并在flpw基因起始密码子前添加组成型PamiC启动子序列；在PamiC的5
’
端设计XbaⅠ酶切位点，在flpw的3
’
端设计KpnⅠ酶切位点，得到5
’
Xba
Ⅰ‑
PamiC
‑
flpw
‑
KpnⅠ3
’
序列(即SEQ ID NO.3)。
[0023]还需要说明的是，本专利技术发现在抗生素抗性基因的两端引入同向FRT位点，再利用位点特异性重组酶Flp对两个同向FRT位点进行准确、高效重组，使FRT位点之间的抗性基因丢失，就能达到无痕敲除并且可以进行多轮基因编辑的目的。
[0024]还需要说明的是，本专利技术实施例以pUC57为载体，构建携带包含上述敲除盒片段的质粒，再利用PCR扩增或者限制性内切酶消化该质粒，得到所需要的游离双链DNA敲除盒片
段。该片段将用于无痕基因敲除的重组系统使用，并在Rhodococcus ruber R1中验证了该系统的可行性。
[0025]在一些具体实施例中，上述用于红球菌基因敲除的重组系统中，抗性基因包括庆大霉素抗性基因。需要说明的是，抗性基因可以为本领域所已知的，比如庆大霉素抗性基因。
[0026]本专利技术另一实施例提供一种基因工程红球菌的构建方法，包括：使用上述用于红球菌基因敲除的重组系统对红球菌进行基因敲除得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于红球菌基因敲除的重组系统，其特征在于，包括：Che9c60&61重组酶质粒、Flp重组酶和游离双链DNA敲除盒片段；游离双链DNA敲除盒片段包括：目的基因上下游同源臂序列及在其间插入包含抗性基因的两个同向FRT序列；Flp重组酶质粒的基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的用于红球菌基因敲除的重组系统，其特征在于，抗性基因包括庆大霉素抗性基因。3.一种基因工程红球菌的构建方法，其特征在于，包括：使用权利要求1或2所述用于红球菌基因敲除的重组系统对红球菌进行基因敲除得基因工程红球菌。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，红球菌为Rhodococcus ruber R1。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，红球菌基因为ΔamiE2。6.根据权利要求3所述的构建方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：马金成，温宇明，游晓琳，王海洪，张文彬，胡喆，黄云超，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：