一种产糠胺的基因工程菌及其制备方法与应用技术

本发明专利技术一种产糠胺的基因工程菌及其制备方法与应用，本发明专利技术属于发酵工程技术领域。本发明专利技术为解决现有生物转氨催化制备糠胺存在氨基供体用量大、价格昂贵、需金属离子辅因子、辅底物用量大等问题。本发明专利技术方法：构建重组大肠杆菌细胞；将诱导表达的重组工程杆菌全细胞加入反应体系；回收全细胞催化剂，制备产品。利用廉价的无机氨基供体，同时利用葡萄糖为辅底物，制备糠胺；有效降低了氨基供体的用量与成本，同时大幅降低了葡萄糖用量，实现生物基糠胺的绿色高效合成。胺的绿色高效合成。胺的绿色高效合成。

【技术实现步骤摘要】
一种产糠胺的基因工程菌及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于发酵工程
，具体涉及一种产糠胺的基因工程菌及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]糠胺(2
‑
Furfurylamine，FLA)，又名2
‑
呋喃甲胺，分子式为C5H7NO，是一种无色油状液体，见光、受热或暴露在空气中会吸收CO2而变质，能溶于乙醇等。糠胺是衍生自糠醛的一种伯胺类化合物，在现代化学和工业中具有多种应用，包括聚合物、农药、生物活性分子的合成以及作为如杀菌剂、胆碱能药、降压药和利尿剂等药物合成的中间体。目前，糠胺主要合成方法以化学法为主，在高温高压的条件下，通过糠醛与液氮进行氢化反应制备，因产物结构特殊，对反应条件要求较为苛刻，后续研究主要围绕催化剂进行改进。目前，各种贵金属催化剂(镍金属，CN1704411A，糠胺产率85％；Ru金属，Research on Chemical Intermediates，2015，42:19
‑
30，糠胺产率60％)均已应用与合成糠胺，但现有的贵金属催化氢化法存在反应条件苛刻、催化剂成本高、收率低等问题，无法实现糠胺的绿色合成。
[0003]生物催化具有选择性高、催化效率高、反应条件温和的优势，例如2017年Alice等(Green Chem，2017，19:397
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404)利用源自Chromobacteium violaceum(DSM30191)的转氨酶(CV
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TAMs)催化糠醛制备糠胺，但目前的转氨反应的氨基供体多为丙氨酸、异丙胺及甲基苄胺等有机胺，其用量大、价格昂贵且部分具有生物致毒性。2021年李清等(Green Chem，2021，23:8154
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8168)利用转氨酶(CV
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TAMs)与丙氨酸脱氢酶(AlaDH)在氯化胆碱/乙二醇
‑
水的两相体系下，利用氯化铵为氨基供体催化合成糠胺，但其级联催化体系存在需要采用氯化胆碱/乙二醇构建反应溶剂体系、金属离子辅因子，且需要大量的辅底物葡萄糖。
[0004]在此基础上针对现有生物转氨催化制备糠胺存在氨基供体用量大、价格昂贵、需金属离子辅因子、辅底物用量大的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了提供一种利用重组大肠杆菌全细胞催化糠醛制备糠胺的绿色高效合成方法，利用廉价的无机氨基供体及葡萄糖制备糠胺，克服了现有生物转氨存在的氨基供体用量大、价格昂贵、需金属离子辅因子、辅底物用量大的问题。
[0006]本专利技术提供一种产糠胺的基因工程菌，所述基因工程菌过表达转氨酶基因OATA和丙氨酸脱氢酶基因ALD。
[0007]进一步地限定，所述基因工程菌被敲除DNA结合转录双调节因子arcA，并过表达转氨酶基因OATA、丙氨酸脱氢酶基因ALD和T7启动子连接碳存储调节因子CsrB基因。
[0008]进一步地限定，所述转氨酶基因OATA，来源于人苍白杆菌，基因序列如SEQ ID NO.3所示；所述丙氨酸脱氢酶基因ALD，来源于来源于谷草芽孢杆菌，Genebank ID：936557；csrB基因序列如SEQ ID NO.1所示；DNA结合转录双调节因子arcA的GeneBank ID为QJZ27444.1。
[0009]进一步地限定，上述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
[0010]本专利技术提供上述的基因工程菌的微生物制剂。
[0011]本专利技术提供一种上述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：
[0012]步骤1：敲除大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA，获得突变菌株I；将T7启动子的序列插入到出发菌株的碳存储调节因子CsrB基因序列前，获得突变菌株II，并制备感受态细胞；
[0013]步骤2：制备含有转氨酶基因OATA、丙氨酸脱氢酶基因ALD的重组质粒，并将重组质粒导入感受态细胞中，获得重组大肠杆菌。
[0014]进一步地限定，步骤1具体步骤为以T7启动子的核苷酸序列为搭桥序列，克隆获得T7
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csrB同源臂；将T7
‑
csrB同源臂连接至自杀质粒pRE112，获得重组质粒pRE112
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T7
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csrB；利用重组质粒pRE112
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T7
‑
csrB介导的同源重组法在突变菌株I的碳存储调节因子csrB基因序列前插入T7启动子的核苷酸序列，获得突变菌株II，命名为E.coli BL21(DE3)
△
arcA T7
‑
csrB。
[0015]本专利技术提供一种全细胞催化制备糠胺的方法，其特征在于，利用上述的基因工程菌在含有糠醛的发酵培养体系中发酵，发酵的温度为37℃，至少12小时。
[0016]进一步地限定，发酵培养体系的成分包括氨基供体、葡萄糖和呋喃
‑2‑
甲醛。
[0017]本专利技术提供上述的基因工程菌在合成糠胺和提高糠胺产量中的应用。
[0018]有益效果：本专利技术的方法针对转氨酶催化糠醛制备糠胺过程所涉及的氨基供体及辅底物，首次利用转氨酶OATA与丙氨酸脱氢酶ALD构建的级联反应，利于无机氨作为氨基供体，氨基供体摩尔用量降低80％，同时利用针对工程杆菌的代谢途径，通过全局性、多水平、多途径的代谢改造组合调控，构建重组大肠杆菌宿主细胞，最终实现辅底物葡萄糖用量降低30％，实现了生物基糠胺的绿色高效合成。
附图说明
[0019]图1为所得糠胺的1H NMR结果。
[0020]图2为所得糠胺的
13
C NMR结果。
[0021]图3为MS结果。
具体实施方式
[0022]实施例1.基因工程菌的构建
[0023]一、基因arcA敲除
[0024]利用P1噬菌体转导法敲除大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组的全局调控因子arcA。
[0025](1)噬菌体活化：10ml无菌的EP管中加入4ml加热融化的0.4％琼脂培养基，加入400μL过夜培养的供体菌株JW4364(该供体菌株来源于Keio Collection文库，可通过商业途径购买，Keio Collection文库构建方法如Baba T,et al.Construction ofEscherichia coli K
‑
12in
‑
frame,single
‑
gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology2006,2(1):1
‑
11)，加入10μL存储的噬菌体原液，将溶液混匀后倒于LB无
抗平板上，37℃湿润环境下培养，直至出现不规则噬菌斑。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产糠胺的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达转氨酶基因OATA和丙氨酸脱氢酶基因ALD。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌被敲除DNA结合转录双调节因子arcA，并过表达转氨酶基因OATA、丙氨酸脱氢酶基因ALD和T7启动子连接碳存储调节因子CsrB基因。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述转氨酶基因OATA，来源于人苍白杆菌，基因序列如SEQ ID NO.3所示；所述丙氨酸脱氢酶基因ALD，来源于来源于谷草芽孢杆菌，Genebank ID：936557；csrB基因序列如SEQ ID NO.1所示；DNA结合转录双调节因子arcA的基因序列如SEQ ID NO.4所示；T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。5.含有权利要求1
‑
3任一项所述的基因工程菌的微生物制剂。6.权利要求1
‑
3任一项所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：步骤1：敲除大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA，获得突变菌株I；将T7启动子的序列插入到出发菌株的碳存储调节因子CsrB基因序列前，获得突变菌株II，并制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，刘耀杰，徐超，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：