一种通过整合极端嗜酸菌分子伴侣CbpA改善E.coli耐酸性的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过整合极端嗜酸菌分子伴侣CbpA改善E.coli耐酸性的方法，属于生物化学与分子生物学领域。本发明专利技术提供一种来自嗜酸喜温硫杆菌的分子伴侣蛋白CbpA及其编码基因；所述分子伴侣蛋白CbpA能够提高大肠杆菌抗酸胁迫能力，并通过基因编辑技术，对E.coli BL21进行基因组改造，获得重组大肠杆菌。通过对野生型BL21、缺陷型BL21

【技术实现步骤摘要】
一种通过整合极端嗜酸菌分子伴侣CbpA改善E.coli耐酸性的方法


[0001]本专利技术涉及一种通过整合极端嗜酸菌分子伴侣CbpA改善E.coli耐酸性的方法，属于生物化学与分子生物学领域。

技术介绍

[0002]在工业生物处理应用中使用的微生物经常遇到多重压力(例如：热、酸、氧化压力、渗透压力以及有毒物质)，对细胞生长和生产力产生负面影响。因此，抗逆性对于保证细胞的生产健壮性至关重要。其中，酸胁迫是最令人关注的胁迫之一，特别是在有机酸和氨基酸的生产过程中。酸性发酵产物或副产物的积累引起发酵液pH的下降，进而引起较低的细胞内pH，导致基本酶的变性和DNA损伤，使微生物生长和生产受到抑制。虽然添加外源碱性物质可以中和发酵液，防止酸扩散到细胞内，但它带来了其他问题，如下游工艺成本增加和产生大量废水。因此，耐酸菌株的运用被认为是一种更有效和更具成本效益的工业发酵解决方案。
[0003]嗜酸喜温硫杆菌(A.caldus)在生物浸出过程中发挥重要作用，因其对酸和重金属的抗性而闻名。它能在极酸性条件下(pH 0.5
‑
1)正常成长的能力在大多数其他生物中是罕见的。作为一种完美的极端微生物，细菌对这种极端环境的酸耐受性越来越受到关注。
[0004]大肠杆菌作为代表性底盘微生物，其基因克隆表达系统具有生长周期短，遗传性能稳定，操作方法简单，表达系统完善等优点，常作为工业微生物用于生产。工业发酵过程，通常有酸性副产物，如乙酸、琥珀酸等生成，导致培养环境会面临一定的酸胁迫压力，提高大肠杆菌对于该类环境的适应性与耐受性，对于工业生产具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种来自嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)的分子伴侣蛋白CbpA及其编码基因；所述分子伴侣蛋白CbpA能够提高大肠杆菌抗酸胁迫能力。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述分子伴侣蛋白CbpA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述分子伴侣蛋白CbpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术提供了一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌为，在大肠杆菌基因组上整合表达了来源于嗜酸喜温硫杆菌的分子伴侣蛋白CbpA。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述分子伴侣蛋白CbpA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述分子伴侣蛋白CbpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌为，采用来源于嗜酸喜温硫杆
菌的分子伴侣蛋白CbpA替代了大肠杆菌基因组上的分子伴侣蛋白CbpA。
[0012]本专利技术还提供了一种上述大肠杆菌工程菌的构建方法，所述方法为：采用含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的cbpA
Ec
基因的引导序列N20序列的整合型载体，将来源于嗜酸喜温硫杆菌的分子伴侣蛋白CbpA整合至大肠杆菌基因组上的分子伴侣蛋白CbpA位点。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述N20序列为：CGTCGGTTTCACGCCCATGA。
[0014]本专利技术还提供了一种提高大肠杆菌抗酸胁迫能力的方法，所述方法为在大肠杆菌基因组上整合表达了来源于嗜酸喜温硫杆菌的分子伴侣蛋白CbpA。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述分子伴侣蛋白CbpA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述分子伴侣蛋白CbpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为，采用来源于嗜酸喜温硫杆菌的分子伴侣蛋白CbpA替代了大肠杆菌基因组上的分子伴侣蛋白CbpA。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述抗酸胁迫能力包括，能够耐受35mM乙酸。
[0019]有益效果
[0020]本专利技术通过将所述编码基因整合到大肠杆菌基因组，验证分子伴侣蛋白CbpA在提高细菌酸耐受方面的作用。
[0021](1)在酸性条件下(pH 5.0)缺陷型菌株BL21
‑
ΔcbpA的最终OD
600
比野生型BL21低8.68％，基因组重组菌株BL21
‑
ΔcbpA/AccbpA的最终生物量比缺陷菌株高4.53％。BL21
‑
ΔcbpA/AccbpA在酸性条件下的生长状况表明cbpA
Ac
对细菌酸耐受性的重要性，其在35mM乙酸胁迫条件下的存活率比BL21
‑
ΔcbpA高7.67倍，比野生型高2.25倍。
[0022](2)通过场发射扫描电子显微镜(FESEM)观察细胞形态，结果显示BL21
‑
ΔcbpA的细胞包膜破损，然而整合有cbpA
Ac
基因的BL21
‑
ΔcbpA/AccbpA的细胞包膜恢复到正常状态。随着胁迫时间的延长，所有菌株细胞内ATP水平逐渐降低。特别是在胁迫5h时，重组菌株比缺陷菌株降低了55.99％，表明重组菌株消耗了大量能量来抵抗酸胁迫。
[0023](3)重组菌株中与耐酸相关的游离氨基酸显着增加，其精氨酸浓度是缺陷型菌株的2倍，天冬氨酸和谷氨酸含量分别比野生型高14.79％和6.23％。本专利技术可为工业发酵过程提供酸耐受性增强的微生物，以提高工业发酵效率。
[0024](4)本专利技术的嗜酸喜温硫杆菌分子伴侣蛋白CbpA及其编码基因在细菌酸耐受方面起重要作用。
附图说明
[0025]图1为实施例1的缺陷型及重组菌株构建流程图。
[0026]图2为实施例1的缺陷型菌株菌落PCR核酸电泳图；其中，M：DNA Marker 5000；+：阳性转化子；
‑
：假阳性转化子。
[0027]图3为实施例1的重组菌株菌落PCR核酸电泳图；其中，M：DNAMarker 5000；+：阳性转化子；
‑
：假阳性转化子。
[0028]图4为实施例2的基因组重组菌株在不同pH条件下的生长曲线；其中，(A)为pH 7.0生长曲线；(B)为pH 5.0生长曲线。
[0029]图5为实施例3的基因组重组菌株对乙酸的耐受性分析菌落图。
[0030]图6为实施例4的FESEM观察细菌的形态结构图；其中(A)为BL21(WT)无酸；(B)为BL21
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ΔcbpA无酸；(C)为BL21
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ΔcbpA/AccbpA无酸；(D)为BL21(WT)35mM乙酸；(E)为BL21
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ΔcbpA35mM乙酸；(F)为BL21
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ΔcbpA/AccbpA35mM乙酸。
[0031]图7为实施例5的胞内ATP测定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌为，在大肠杆菌基因组上整合表达了来源于嗜酸喜温硫杆菌的分子伴侣蛋白CbpA。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述分子伴侣蛋白CbpA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，编码所述分子伴侣蛋白CbpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求3所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌为，采用来源于嗜酸喜温硫杆菌的分子伴侣蛋白CbpA替代了大肠杆菌基因组上的分子伴侣蛋白CbpA。5.权利要求1～4任一所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法为：采用含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的cbpA
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基因的引导序列N20序列的整合型载体，将来源于...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯守帅，杨海麟，蒋振明，仝艳军，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：