生产微菌素J25的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及生产微菌素J25的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株、构建方法及应用，属于微生物技术、药物和基因工程领域，本发明专利技术通过对mcjABCD基因序列和表达原件的优化，使得MccJ25可以在枯草芽孢杆菌中成功表达，并将mcjABCD基因同时整合至枯草芽孢杆菌基因组两个位点中，得到一株可以高效生产MccJ25的枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株，该菌可以在无抗性、无诱导、双位点共表达且无芽孢生成的条件下，对MccJ25具有较高的表达水平，并且表达产物对于肠炎沙门氏菌具有良好的杀菌活性，为MccJ25的生产应用开发了新的应用模式。的生产应用开发了新的应用模式。的生产应用开发了新的应用模式。

【技术实现步骤摘要】
生产微菌素J25的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株、构建方法及应用


[0001]本专利技术属于微生物技术、药物和基因工程领域，具体涉及一种生产微菌素J25的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌作为食品级益生菌，可以直接作为饲料添加剂进入动物体内，在畜牧业生产领域发挥极大地作用，此外，其在医疗、食品以及外源蛋白生产方面也被广泛应用。Amye基因是枯草芽孢杆菌常用的高效稳定的整合位点，并且具有非常好的外源蛋白表达能力，SigF基因是RNA聚合酶sigma
‑
F因子，是枯草芽孢杆菌芽孢形成的关键因子，阻断SigF基因的表达，使得枯草芽孢杆菌在高密度发酵过程中不会形成孢子，芽孢污染程度小。
[0003]MccJ25是一种在大肠杆菌中发现的细菌素I类抗菌小肽，其对部分大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌具有较强的杀伤作用。MccJ25具有21个氨基酸组成的套索结构，是由N端的第9
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21个氨基酸形成的β发夹结构贯穿第1
‑
8个氨基酸形成的环状结构所形成。MccJ25的生物合成需要四个基因参与，即mcjABCD，mcjA编码MccJ25的线性氨基酸前体，mcjB和mcjC编码mcjA翻译后修饰蛋白，mcjD编码转运蛋白，成熟的MccJ25对极端的环境具有一定的耐受性。目前，MccJ25的分泌表达与实际生产大多都是以肠杆菌作为表达菌株，极少有人使用枯草芽孢杆菌表达MccJ25，作为食品级益生菌，其表达的MccJ25在生产应用上具有更经济快捷的使用方法，此外，由于MccJ25的杀菌机理不同于抗生素，且在生产过程中无抗性，无诱导，所以由枯草芽孢杆菌生产的MccJ25可以通过活菌或灭活菌的方式直接添加至畜禽饲料，作为良好的治疗细菌性疾病的产品。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术通过对mcjABCD基因序列和表达原件的优化，使得MccJ25可以在枯草芽孢杆菌中成功表达，并将mcjABCD基因同时整合至枯草芽孢杆菌基因组两个位点中，得到一株可以高效生产MccJ25的枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株，该菌可以在无抗性、无诱导、双位点共表达且无芽孢生成的条件下，对MccJ25具有较高的表达水平，并且表达产物对于肠炎沙门氏菌具有良好的杀菌活性，为MccJ25的生产应用开发了新的应用模式。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的具体方案如下：
[0006]本专利技术的第一方面，是提供一种生产微菌素J25的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株，通过双交叉同源重组法，将mcjABCD基因分别插入枯草芽孢杆菌原始菌株的Amye和SigF位点，对MccJ25进行双位点的组成型表达构建所得。
[0007]优选地，所述枯草芽孢杆菌原始菌株为枯草芽孢杆菌WB800N菌株。
[0008]优选地，Amye位点为枯草芽孢杆菌WB800N菌株α
‑
淀粉酶基因，SigF位点为枯草芽孢杆菌WB800N菌株RNA聚合酶σ
‑
因子基因。
[0009]优选地，所述mcjABCD基因序列，是将mcjA和mcjBCD的基因序列调整为相同方向，
设计由P
43
启动子启动mcjA基因的表达，由P
veg
启动子启动mcjBCD基因的表达，并且通过终止子对mcjA基因进行终止转录。
[0010]本专利技术的第二方面，是提供上述枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株的构建方法，包括以下步骤：步骤一、通过基因合成与重叠PCR技术，获得优化的mcjABCD基因序列；步骤二、将步骤一所述的mcjABCD基因克隆至PMD
‑
19T质粒，将克隆产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，从中挑选阳性转化子进行扩大培养，提取质粒，并将鉴定正确的重组质粒置于
‑
20℃保存备用；步骤三、采用双交叉同源重组法，将mcjABCD基因分别插入枯草芽孢杆菌WB800N菌株的Amye和SigF位点，对MccJ25进行双位点的组成型表达，得到生产MccJ25的枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株。
[0011]本专利技术的第三方面，是提供上述枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株在生产微菌素J25方面的应用。
[0012]本专利技术的第四方面，是提供一种利用上述枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株生产微菌素J25的方法，将所述枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株接种到液体培养基中进行培养，获得微菌素J25；所述培养的条件为：37℃、220r/min。
[0013]本专利技术的第五方面，是提供一种杀菌制剂，包含上述枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株或/和其产生的微菌素J25。
[0014]本专利技术的第六方面，是提供上述枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株或上述杀菌制剂在制备治疗细菌性疾病的产品中的应用。所述细菌优选为肠炎沙门氏菌。
[0015]本专利技术相比于现有技术，具有以下技术效果：本专利技术提供一株生产微菌素J25(MccJ25)的枯草芽孢杆菌重组整合菌株(W25AS2)，该工程菌在枯草芽孢杆菌WB800N菌株的Amye和SigF两个基因位点同时无痕插入改造后的mcjABCD基因序列，使得该工程菌在正常生长的情况下，可以对MccJ25有较高的表达水平，其表达产物对肠炎沙门氏菌具有非常好的杀伤性。此外，由于菌本身形成芽孢的功能缺失，使得枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株可以通过温度控制其活性，对于菌株的生长情况可以做到良好的控制。枯草芽孢杆菌W25AS2菌株的成功构建，标志着枯草芽孢杆菌可以低成本(无诱导)，高安全(益生菌且无抗性)的生产MccJ25，并且可以通过活菌或灭活菌的方式直接添加至畜禽饲料，可以作为良好的治疗细菌性疾病的产品。
附图说明
[0016]图1是枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株的构建示意图。
[0017]图2是枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株表达MccJ25质谱分析图，其中a和b表示枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株表达MccJ25的ESI
‑
MS分析，检测到对应带电荷MccJ25的m/z值以703.858Da[M+3H]3+
、1055.14Da[M+2H]2+
和2108.987Da[M+H]+
，x轴表示m/z(Da)值，y轴表示响应值；其中c和d表示在枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株表达上清中检测到的MccJ25异源表达，x轴表示保留时间，y轴表示响应值。
[0018]图3是枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株表达MccJ25对肠炎沙门氏菌的杀菌效果图：a为50μL点样，b为梯度样本点样，顺序由右上—左上(20、21、22、23、24、25)。
[0019]图4是枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株和枯草芽孢杆菌WB800N菌株的芽孢产生验证图：分别在60℃、70℃、80℃和100℃的环境中检测温度耐受性。
具体实施方式
[0020]枯草芽孢杆菌W25AS2工程菌株的构建与应用，具体步骤如下：1、通过基因合成与重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产微菌素J25的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株，其特征在于：通过双交叉同源重组法，将mcjABCD基因分别插入枯草芽孢杆菌原始菌株的Amye和SigF位点，对MccJ25进行双位点的组成型表达构建所得。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌原始菌株为枯草芽孢杆菌WB800N菌株。3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株，其特征在于：所述Amye位点为枯草芽孢杆菌WB800N菌株α
‑
淀粉酶基因，SigF位点为枯草芽孢杆菌WB800N菌株RNA聚合酶σ
‑
因子基因。4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株，其特征在于：所述mcjABCD基因序列，是将mcjA和mcjBCD的基因序列调整为相同方向，设计由P
43
启动子启动mcjA基因的表达，由P
veg
启动子启动mcjBCD基因的表达，并且通过终止子对mcjA基因进行终止转录。5.根据权利要求1
‑
4任意一种所述的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、通过基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖明，张广文，冯赛祥，代绘琳，谢倩梅，江金飞，许斯祺，林敏，秦苗苗，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：